朱曉駿 孫學(xué)華 李 璐 高月求

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科 (上海，200021)

靈貓方是本院肝病科治療慢性乙型肝炎 (CHB)的常用方劑，本文擬采用血清藥理學(xué)的研究方法［1］來(lái)驗(yàn)證其體外抑制乙肝病毒 (HBV)的效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株 SD雄性大鼠15只，體重250～300g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HepG 2.2.15細(xì)胞，由上海公共衛(wèi)生中心惠贈(zèng)。

1.2 主要藥品 靈貓方中藥顆粒劑由江陰天江制藥有限公司提供，批號(hào)：0912302，醋青皮1.5g(相當(dāng)于生藥9g)，黃芪2.25g(相當(dāng)于生藥15g)，胡黃連1.5g(相當(dāng)于生藥9g)，貓爪草1.5g(相當(dāng)于生藥15g)，仙靈脾0.75g(相當(dāng)于生藥15g)，女貞子1.5g(相當(dāng)于生藥15g)。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基(GIBCO進(jìn)口分裝);0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶0.25g(Difeo進(jìn)口分裝);小牛血清：杭州四季青生物公司生產(chǎn);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices產(chǎn)品。

1.4 靈貓方含藥血清的制備 將15只成年大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法，平均分為3組，每組5只，分別為10倍靈貓方組(簡(jiǎn)稱10倍組)，5倍靈貓方組 (簡(jiǎn)稱5倍組)，生理鹽水組(簡(jiǎn)稱鹽水組)。大鼠給藥量按照10倍、5倍成人標(biāo)準(zhǔn)體重(50Kg為標(biāo)準(zhǔn)體重)計(jì)算。靈貓方顆粒劑給藥劑量：10倍靈貓方組為0.18g·100g-1d-1，5倍靈貓方組為0.09g·100g-1d-1。各組動(dòng)物在同等條件下飼養(yǎng)，生理鹽水組及中藥組大鼠每日早晚各1次空腹灌胃，連續(xù)3天，末次給藥1小時(shí)后空腹苯巴比妥麻醉，腹主動(dòng)脈采血，在無(wú)菌條件下靜置2小時(shí)以上，3 000rpm離心10～15分鐘分離血清，56℃水浴箱內(nèi)放置30分鐘，應(yīng)用0.22μm微孔膜過(guò)濾除菌，分裝，置于 -80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測(cè) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG 2.2.15細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板(2.0 ×104細(xì)胞/孔)，分別加入培養(yǎng)液100μl/每孔。在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后換入含藥培養(yǎng)液 (含藥血清用培養(yǎng)液按1∶10稀釋加入培養(yǎng)孔)，每72小時(shí)更換新鮮含藥培養(yǎng)液，共3次，換出的細(xì)胞上清液用于檢測(cè)HBsAg、HBeAg(酶聯(lián)免疫法)。具體操作如下：①每孔加入待測(cè)樣品50μl，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各兩孔，每孔加入陰性對(duì)照 (或陽(yáng)性對(duì)照)各50μl，并設(shè)空白對(duì)照1孔;②每孔加入酶結(jié)合物50μl(空白對(duì)照孔除外)，充分混勻，封板，置37℃孵育30分鐘;③棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干;④每孔加顯色劑A液、顯色劑B液各50μl，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘;⑤每孔加入終止液50μl，混勻;⑥用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)HBsAg和HBeAg抑制率按下列公式計(jì)算：抑制率=(生理鹽水組OD值 -含藥血清組OD值)×100%/生理鹽水組OD值。OD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，P≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中 HBsAg的抑制作用 見(jiàn)表1。分析不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中的HBsAg抑制率，顯示第6天達(dá)到最高峰，此后下降。

2.2 3 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中HBeAg的抑制作用 見(jiàn)表2。分析不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中的HBeAg抑制率，顯示第6天達(dá)到最高峰，此后下降。

3 討論

在我國(guó)一般人群的HBsAg陽(yáng)性率為7.18% ，接種與未接種乙型肝炎疫苗人群的 HBsAg陽(yáng)性率分別為 4.51% 和9.51%［2］。CHB 5年發(fā)生肝硬化的幾率是8% ～20%，發(fā)生肝硬化后5年內(nèi)發(fā)生失代償?shù)膸茁适?0%，代償期的肝硬化5年生存率是80%～86%，失代償期患者的5年生存率是14%～35%，每年在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生肝細(xì)胞癌是2% ～5%［3］。目前對(duì)CHB的治療，主要是選用干擾素和核苷酸類似物，這些藥物對(duì)病毒有良好地抑制作用，但存在副作用大、病毒變異，停藥后容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。而采用中藥可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒等多方面起作用。

中藥復(fù)方不能直接用于培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)藥物血清驗(yàn)證其對(duì)HBsAg、HBeAg的作用，是目前一種簡(jiǎn)單可行的方法。HepG 2.2.15細(xì)胞是HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV 全基因序列［4］，因能夠穩(wěn)定分泌HBV而廣泛應(yīng)用于體外研究。靈貓方是在補(bǔ)腎法治療CHB的基礎(chǔ)之上，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的，我們發(fā)現(xiàn)單純應(yīng)用清熱化濕的方法，治療CHB的效果并不佳，在清熱化濕的同時(shí)應(yīng)用補(bǔ)腎法則往往能提高療效。靈貓方具有補(bǔ)腎和清熱化濕的作用。本實(shí)驗(yàn)證明靈貓方藥物血清能夠抑制HBV，值得進(jìn)一步研究。

［1］方肇勤主編.實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)［M］.第3版，上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2008：212-213.

［2］梁曉峰，陳園生，王曉軍，等.中國(guó)3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學(xué)研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2005，26(9)：655-658.

［3］EASL.Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B［J］.Hepatology ，2009，50(2)：227-242.

［4］SELLS MA，CHEN ML，ACS G.Production of hepatitis B virus particles in HepG cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA［J］.PNAS，1987，84(4)：1005-1009.

表13 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg抑制作用比較(±s)

表13 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg抑制作用比較(±s)

與生理鹽水組比較，*P＜0.001;與5倍藥物血清組比較，△P＞0.05

組別 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)鹽水組3 1.754 ±0.012 2.876 ±0.011 3.288 ±0.010 5 倍組 3 1.277 ±0.008* 27.2 1.156 ±0.011* 59.8 1.986 ±0.011* 39.6 10倍組 3 1.262 ±0.011＊△ 28.0 1.146±0.012＊△ 60.1 1.977±0.011＊△39.9

表23 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBeAg抑制作用比較(±s)

表23 組血清對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞HBeAg抑制作用比較(±s)

與生理鹽水組比較，＊＊P＜0.01;與5倍藥物血清組比較，△P＞0.05

組別 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)鹽水組3 1.584 ±0.013 2.785 ±0.011 3.326 ±0.009 5倍組 3 1.019 ±0.008＊＊ 35.7 1.026±0.013＊＊ 63.1 1.889±0.010＊＊ 43.2 10倍組 3 1.012±0.010＊＊△ 36.1 1.014±0.0110＊＊△ 66.1 1.8776±0.0094＊＊△43.6