盧文麗 方肇勤 潘志強(qiáng) 梁 超 管冬元 吳中華 劉小美

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (上海，201203)

原發(fā)性肝癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，而中醫(yī)藥在肝癌的防治中，在改善患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)帶瘤生存期等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)藥防治肝癌的特點(diǎn)是辨證論治，即依據(jù)“同病異證”實(shí)施“同病異治”。揭示同病異證發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是學(xué)術(shù)界長(zhǎng)期以來(lái)一直關(guān)心的問(wèn)題，也是探索和發(fā)展肝癌辨證論治方法的重要前提。

鑒于學(xué)術(shù)界以往研究證實(shí)中醫(yī)常見(jiàn)證候與神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)有關(guān)［1，2］，同時(shí)該系統(tǒng)中甲狀腺作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌腺與中醫(yī)證候密切相關(guān)，而以往國(guó)內(nèi)外肝癌防治研究中尚未涉及該層面，因此我們采用小鼠標(biāo)準(zhǔn)化、計(jì)量化檢測(cè)方法，篩選出邪盛衰度不同的荷瘤小鼠，同時(shí)兼顧氣虛證，檢測(cè)其血清T3、T4激素水平，同步觀察甲狀腺激素合成密切相關(guān)的Tshr、Tpo、Tg、Nis等4個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平，有利于揭示腫瘤邪毒盛衰程度與甲狀腺機(jī)能及其基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株 昆明種小鼠，雄性，250只，體重22±2g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2007-0005，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2009-0069。小鼠H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院藥物所。

1.2 主要試劑 小鼠總?cè)饧谞钕僭彼?(T3)和小鼠總甲狀腺素 (T4)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Calbiotech公司。Takara SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參：基因Tshr上游5'-GACAACGAGGACATGGTGTG-3'，下游5'-GGCTGGTTAGCAGAATGAGC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度154bp;基因Tpo上游5'-TGACTTCCAGGAGCACACAG-3'， 下 游 5'-CAGGAGGCCTCTCACTATCG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 112bp;基因 Nis上游 5'-CCGATCAGTACATGCCATTG-3'，下 游 5'-CAGCTGCCATAGCGTTGATA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度132bp;基因Tg上游5'-CAGCCAGTCTTCTGTGGTCA-3'，下游 5'-TCTGTGAGGAGCGTGACATC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 156bp;GAPDH上游 5'-TGTTCCTACCCCCAATGTGT-3'，下游5'-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度400bp。

1.3 主要儀器 ROTOR GENE 3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Corbett Research公司)，Elx800型酶標(biāo)儀和Elx50型自動(dòng)洗板機(jī) (美國(guó)Bio-TEK公司)，F(xiàn)R-200A生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)。YLS-13A小鼠抓力儀 (山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站);SQF-EA體視顯微鏡 (上海萬(wàn)科儀器有限公司);WMY-01數(shù)字溫度計(jì) (上海華辰醫(yī)用儀表有限公司);MP200B電子天平 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司);0-125mm游標(biāo)卡尺 (上海量具刃具廠);曠場(chǎng)檢測(cè)小鼠實(shí)驗(yàn)籠用4.5cm×5.5cm方格 (課題組自制);NIKON4500數(shù)碼相機(jī)等。

1.4 動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)取20只作正常對(duì)照。另230只小鼠，全部腋下接種0.2 ml細(xì)胞液 (含細(xì)胞數(shù)為8×106個(gè))。接種后第6天淘汰死亡、未出瘤、出瘤不佳小鼠10只，腫瘤小鼠220只。共計(jì)240只用于第7日四診計(jì)量檢測(cè)和辨證，篩選獲得如下同病異證各證型腫瘤小鼠：①正常對(duì)照組 (簡(jiǎn)稱(chēng)正常組)，取氣血陰陽(yáng)盛衰度居中接近1.0者。腫瘤小鼠則以邪盛衰度大小排序，淘汰陽(yáng)虛瀕臨死亡者。②邪毒壅盛瀕危組 (簡(jiǎn)稱(chēng)瀕危組)，取邪盛衰度最為嚴(yán)重，或兼有輕度陽(yáng)氣虛者。③邪毒壅盛組 (簡(jiǎn)稱(chēng)邪毒組)，取邪盛衰度次于上組，兼證少者。④邪毒居中兼氣虛組 (簡(jiǎn)稱(chēng)氣虛組，與邪毒居中組對(duì)照)。⑤邪毒居中組 (簡(jiǎn)稱(chēng)邪中組)。⑥邪毒微弱組 (簡(jiǎn)稱(chēng)邪微組)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及處理

1.5.1 小鼠四診計(jì)量化指標(biāo)檢測(cè)及辨證［3，4］進(jìn)行檢測(cè)、辨證分組。接種后第7天，四診計(jì)量化檢測(cè)指標(biāo)包括：體重、腋溫、曠場(chǎng)及計(jì)算35秒內(nèi)水平跨格數(shù)和垂直站立數(shù)、抓力、爪和尾顯微拍照及提取r值 ［r=R/(R+G+B)，photoshop圖象處理后獲得R、G、B值，R代表紅色，G代表綠色，B代表藍(lán)色;r值能反映小鼠爪尾的紅色程度。］和腫瘤長(zhǎng)短徑。獲得以上四診數(shù)據(jù)后，辨證方法及標(biāo)準(zhǔn)如下：①估算瘤體積和瘤重 (cm3) =abb/2(a代表腫瘤的長(zhǎng)徑，b代表腫瘤的短徑)，去瘤體重 (g) =體重-估算瘤體積 (假設(shè)腫瘤比重為1)。②邪盛衰度=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn)：各荷瘤小鼠比較，＞2為邪毒壅盛; ＞1.5為邪毒甚，＜0.75為邪較弱; ＜0.5為邪弱。③氣盛衰度=各小鼠水平移動(dòng)實(shí)測(cè)值/正常組均數(shù)×0.3+各小鼠直立次數(shù)/正常組均數(shù)×0.2+各小鼠四肢抓力實(shí)測(cè)值/正常組均數(shù)×0.5。辨證標(biāo)準(zhǔn)：與正常組比較，＞1.5為氣盛，＜0.75為氣虛，＜0.5為氣虛甚，＜0.25為氣虧。④血盛衰度=爪r/正常組均數(shù)×0.7+尾r/正常組均數(shù)×0.3。辨證標(biāo)準(zhǔn)：與正常組比較，＞1.1為血充盈，＜0.95為血虛，＜0.9為血虛重，＜0.85為血虧。⑤陰盛衰度=各小鼠去瘤體重/正常組均值。辨證標(biāo)準(zhǔn)：與正常組比較，＞1.2為形豐，＜0.9為陰偏虛，＜0.85為陰虛，＜0.7為陰虧，＜0.6為液脫。⑥陽(yáng)盛衰度=各小鼠腋溫/正常組均數(shù)×0.3+各小鼠爪r/正常組均數(shù)×0.5+各小鼠尾r/正常組均數(shù)×0.2。辨證標(biāo)準(zhǔn)：與正常組比較，＞1.02為陽(yáng)盛，＜0.98陽(yáng)虛，＜0.95陽(yáng)虛重，＜0.9陽(yáng)損。根據(jù)以上辨證標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得不同組別小鼠。

1.5.2 測(cè)定小鼠血清甲狀腺激素T3及T4 接種后第8天，動(dòng)物處死前摘除眼球取血，制備血清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 腫瘤重量測(cè)定 接種后第8天，引頸處死動(dòng)物，取腫瘤組織，稱(chēng)重。

1.5.4 檢測(cè)小鼠甲狀腺相關(guān)基因mRNA水平［5，6］①接種后第8天，引頸處死動(dòng)物，取甲狀腺組織。②同組所有動(dòng)物組織樣本合并，常規(guī)采用Trizol抽提RNA、OD值測(cè)定、反轉(zhuǎn)錄(RT)、RTqPCR Real-time quantitative PCR及電泳。RTqPCR程序如下：95℃，30秒;95℃，15秒→60℃，45秒，40個(gè)循環(huán)。③采用△△CT法分析RTqPCR檢測(cè)結(jié)果，以正常組作為對(duì)照樣本?！鳌鰿T=(觀察樣本目的基因CT-觀察樣本內(nèi)參CT)-(對(duì)照樣本目的基因CT-對(duì)照樣本內(nèi)參CT)，樣本的相對(duì)表達(dá)量 =2-△△CT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［7］采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(±s)表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為0.05。方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett C法。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 240只小鼠，第7天四診計(jì)量化指標(biāo)檢測(cè)和辨證后，從正常組20只中篩選出14只，淘汰6只。從220只腫瘤小鼠中共篩選出80只，淘汰140只，其中瀕危組21只，至次日自然死亡4只，第8日實(shí)際處死14只;邪毒組17只，至次日自然死亡3只，實(shí)際處死14只;氣虛組小鼠14只，至次日自然死亡4只，實(shí)際處死10只;邪中組小鼠14只，至次日自然死亡1只，實(shí)際處死13只;邪微組小鼠14只，實(shí)際處死14只。各組入選小鼠第7～8日隔夜死亡率見(jiàn)圖1。

圖1 各組入選小鼠隔夜死亡率

2.2 各組小鼠處死時(shí)腫瘤重量 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腫瘤大小比較 (±s)

表1 各組小鼠腫瘤大小比較 (±s)

與邪中組比較，▲P＜0.05

組別 n 腫瘤重量 (g)正常組14瀕危組 14 2.56 ±0.64▲邪毒組 14 2.20 ±0.43▲氣虛組 10 2.36 ±0.52▲邪中組 13 1.71 ±0.65邪微組 14 1.07 ±0.55▲

由表1可見(jiàn)，腫瘤小鼠的實(shí)際瘤重按瀕危組、邪毒組、邪中組、邪微組依次減輕，與邪盛衰度趨勢(shì) (表2)十分類(lèi)似，也提示活體體表測(cè)量及計(jì)算瘤體積方法的正確性;其中邪中組與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。值得注意的是，氣虛組小鼠的腫瘤重量高于邪中組，可能與其氣虛程度嚴(yán)重，腫瘤隔夜增長(zhǎng)迅速有關(guān)。

2.3 各組小鼠證候及其程度 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠證候及其程度比較(±s)

表2 各組小鼠證候及其程度比較(±s)

與正常組比較，#P＜0.05;與邪中組比較，▲P＜0.05;與氣虛組比較，★P＜0.05

組別 n 邪盛衰度 氣盛衰度 血盛衰度 陰盛衰度 陽(yáng)盛衰度正常組 14 1.03 ±0.18★1.00 ±0.01 1.00 ±0.03 1.00 ±0.01瀕危組 14 1.66 ±0.21▲0.56 ±0.16#0.98 ±0.01#1.09 ±0.15 0.98 ±0.02#邪毒組 14 1.30 ±0.04▲0.72 ±0.21#★0.99 ±0.01#1.09 ±0.13 0.99 ±0.02氣虛組 10 1.00 ±0.12▲0.41 ±0.08#1.00 ±0.02 1.09 ±0.09 0.98 ±0.02邪中組 13 0.95±0.15 0.91 ±0.11★1.00 ±0.02 1.08 ±0.08 0.99 ±0.01邪微組 14 0.39±0.13▲0.83 ±0.21★1.00 ±0.01 1.03 ±0.06 1.00 ±0.01

由表2可見(jiàn)：①邪盛衰度：瀕危組、邪毒組、氣虛和邪中組、邪微組等邪盛衰度依次減小。除氣虛組與邪中組接近外，其余組別與之比較差異均有顯著性意義 (P＜0.05)。②氣盛衰度：與正常組比較，瀕危組、邪毒組、氣虛組差異有統(tǒng)計(jì)意義 (P＜0.05)。氣虛組氣盛衰度最小，除瀕危組外，其他組與氣虛組比較差異均有顯著性意義 (P＜0.05)。依據(jù)氣盛衰度辨證標(biāo)準(zhǔn)，小于0.5為氣虛甚，表明本實(shí)驗(yàn)氣虛組小鼠的氣虛程度十分嚴(yán)重，這可能是其預(yù)后差的主要原因。③血盛衰度：與正常組比較，瀕危組、邪毒組血盛衰度下降(P＜0.05)，但未達(dá)到血虛證標(biāo)準(zhǔn)。④陰盛衰度：各組間小鼠陰盛衰度比較，差異均無(wú)顯著性意義 (P＞0.05)。⑤陽(yáng)盛衰度：與正常組比較，瀕危組陽(yáng)盛衰度下降，差異有顯著性意義 (P＜0.05)。但未達(dá)到陽(yáng)虛證標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 各組小鼠血清甲狀腺激素T3、T4水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清甲狀腺激素水平比較(±s)

表3 各組小鼠血清甲狀腺激素水平比較(±s)

與正常組比較，#P＜0.05;與邪中組比較，▲P＜0.05

組別 n T3(ng/ml) T4(μg/dl)正常組 14 2.007 ±0.157 6.967 ±0.180▲瀕危組 14 1.663±0.166▲ 3.143±0.571#▲邪毒組 14 1.774 ±0.315 3.155 ±0.826#▲氣虛組 10 1.876 ±0.270 3.425 ±0.901#▲邪中組 13 2.090 ±0.131 4.396 ±0.716#邪微組 14 2.106 ±0.119 5.927 ±0.560#▲

與正常組比較，T3在腫瘤早期、在邪微組和邪中組，有升高趨勢(shì)，而隨著邪盛衰度程度增加，則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性意義 (P＞0.05);瀕危組較邪中組T3下降 (P＜0.05)。而T4在腫瘤發(fā)生后迅速抑制，與正常組比較，各組均出現(xiàn)下調(diào) (P＜0.05);其中邪中組與其他組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.05)。

2.5 各組小鼠甲狀腺激素合成關(guān)鍵基因RTqPCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2～9。

圖2 各組小鼠Tshr相對(duì)表達(dá)量

圖3 各組小鼠Tpo相對(duì)表達(dá)量

圖5 各組小鼠Tg相對(duì)表達(dá)量

圖6～9注：M：marker;1：正常組;2：瀕危組;3邪毒組;4氣虛組;5邪中組;6邪微組。Marker中最亮條帶為500bp，往下逐漸減少100bp。

分析圖2～圖9：①Tshr：由圖2可見(jiàn)，與正常組比較，Tshr的表達(dá)在瀕危組、邪毒組和氣虛組出現(xiàn)遞減趨勢(shì)，邪中組、邪微組表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)。其中氣虛組表達(dá)量最低，而邪微組表達(dá)量最高。電泳條帶見(jiàn)圖6。②Tpo：由圖3可見(jiàn)，與正常組比較，Tpo的表達(dá)氣虛組明顯下調(diào)，邪微組則明顯上調(diào)。電泳條帶見(jiàn)圖7。③Nis：由圖4可見(jiàn)Nis的表達(dá)與正常組比較，瀕危組、邪毒組、氣虛組、邪中組均出現(xiàn)明顯下調(diào)，邪微組則明顯上調(diào)。電泳條帶見(jiàn)圖8。④Tg：由圖5可見(jiàn)，Tg的表達(dá)在邪毒組、邪中組、氣虛組均有下調(diào)趨勢(shì)，且氣虛組表達(dá)量最低;邪微組明顯上調(diào)。電泳條帶見(jiàn)圖9。

3 討論

筆者在以往長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如腫瘤小鼠，存在著類(lèi)似于人類(lèi)的證候的自然發(fā)生和同病異證的表現(xiàn)［3，4］：如給昆明種小鼠腋下接種同樣濃度和劑量的H22腹水癌細(xì)胞后，在小鼠出瘤的早期，腫瘤體積差距很大：部分動(dòng)物早期腫瘤生長(zhǎng)迅速，瘤體積大，死亡早，預(yù)后差，類(lèi)似人類(lèi)臨床“邪毒壅盛證 (型)”;此外，除腫瘤“痰、熱、瘀、毒”等邪毒的基本證候外，腫瘤發(fā)生后，荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成氣、血、陰、陽(yáng)等虛證表現(xiàn)，并隨著病情發(fā)展和邪盛衰度嚴(yán)重而加?。?］。如腫瘤早期出現(xiàn)“氣虛證”，表現(xiàn)為腫瘤相對(duì)較小，自主活動(dòng)減少、抓力下降等證候。

本次所篩選不同組別H22荷瘤小鼠證候情況如下：邪盛衰度方面，瀕危組、邪毒組、氣虛和邪中組、邪微組等邪盛衰度依次減小;氣盛衰度總體上與邪盛衰度呈正相關(guān)，其中氣虛組最為嚴(yán)重;各證候未見(jiàn)陰虛證兼夾情況;血盛衰度、陽(yáng)盛衰度總體上與邪盛衰度呈正相關(guān)，其中瀕危組兩證候均出現(xiàn)下降，但均未達(dá)到相應(yīng)的辨證標(biāo)準(zhǔn)。

甲狀腺激素水平方面，在腫瘤早期邪毒程度較輕者，如邪中組和邪微組，T3與正常組接近且有升高趨勢(shì)，而隨著邪盛衰度程度增加，則出現(xiàn)下降趨勢(shì);T4在腫瘤發(fā)生后迅速出現(xiàn)抑制，隨著邪盛衰度越重抑制越甚。以上結(jié)果提示：腫瘤發(fā)生后，機(jī)體甲狀腺總體處于抑制狀態(tài)，且邪盛衰度越重抑制越甚。

Tshr、Tpo、Nis、Tg為甲狀腺重要的功能標(biāo)志性基因［9，10］：甲狀腺激素的合成和分泌主要受到甲狀腺上游組織垂體的調(diào)控，Tshr與垂體分泌的Tsh相結(jié)合而啟動(dòng)該過(guò)程;Tpo參與甲狀腺激素合成中碘的活化及碘化酪氨酸耦聯(lián);Nis在甲狀腺激素合成中對(duì)碘的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用;Tg是甲狀腺激素的前體。以上基因RTqPCR檢測(cè)結(jié)果存在如下總體趨勢(shì)：①不同邪盛衰度，程度輕者表達(dá)量相對(duì)較高，程度重者表達(dá)量相對(duì)較低，如邪中組和邪微組表達(dá)量多較高。與甲狀腺激素變化趨勢(shì)大體一致。②氣虛組表達(dá)量多為最低，可能與該組氣虛程度嚴(yán)重，隔夜腫瘤生長(zhǎng)迅速，實(shí)際邪盛衰度增加，死亡率較高有關(guān)。

以上結(jié)果綜合提示：①腫瘤邪盛衰度與荷瘤小鼠甲狀腺抑制程度有關(guān)。當(dāng)邪毒微弱時(shí)，甲狀腺尚處于積極的代償狀態(tài);隨著腫瘤邪盛衰度的增加，甲狀腺轉(zhuǎn)而出現(xiàn)失代償狀態(tài)，呈現(xiàn)抑制，是因?qū)嵵绿摗＂谕‘愖CH22肝癌小鼠甲狀腺激素水平變化，總體上與激素合成Tshr等關(guān)鍵基因變化一致，提示腫瘤發(fā)生后激素合成關(guān)鍵基因亦發(fā)生相應(yīng)變化，從而影響了甲狀腺激素水平。

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