諸葛麗 蘇冬梅 李 健 楊美娟 劉云霞 李軍祥△

1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院消化內(nèi)科 (北京，100078) 2.北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人體形態(tài)學系

NASH是非酒精性單純性脂肪肝 (NAFL)向非酒精性脂肪性肝硬化 (NAC)進展過程中的重要環(huán)節(jié)，是隱源性肝硬化的重要原因之一［1］。NASH發(fā)病機制不明確，目前國際上公認的為“二次打擊學說”。在NASH發(fā)病的“第二次打擊”中，NF-κB促炎信號傳導通路及PPARr抗炎信號傳導通路的失衡是導致脂肪性炎癥發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一［2］。姜黃素是一種多酚類化合物，主要存在于姜科及天南星科植物的根莖中。它是我國常用中藥姜黃、郁金、莪術(shù)、石菖蒲中的主要有效化學成分。研究表明姜黃素可抑制多種原因誘發(fā)的肝臟疾?。?］，具有抗纖維化，抗炎以及線粒體保護等作用。目前針對姜黃素干預(yù)NASH的研究較少，且主要集中在療效方面，并沒有進一步探討其作用機制。本文通過建立MCD飲食誘導的小鼠NASH模型，研究并探討中藥單體姜黃素對NASH的炎癥信號傳導通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗選用8～12周齡C57/BL6雄性♂小鼠，體重20±2g，(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)。實驗動物常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學清潔級動物房，12小時光照和黑夜循環(huán)，溫度 (22±2)℃，濕度50% ～60%。

1.2 實驗用飼料、藥物、主要試劑及儀器 MCD飼料的配方參考國外文獻［4］。MCS飼料配方［5］，即MCD對照飼料，是在MCD飼料配方基礎(chǔ)上，加上膽堿2g/Kg、蛋氨酸3g/Kg。MCD及MCS飼料均由江蘇南通特洛菲飼料有限公司加工制作，為清潔級飼料，4℃低溫保存。姜黃素由西安冠宇生物技術(shù)有限公司提供，98%標準品。姜黃素灌胃用藥劑量按實驗動物與人體體表面積比等效量核算比率，計算出小鼠的等效劑量為1.15g/kg，溶劑選用DMSO。油紅O及HE染色相關(guān)試劑購自美國Sigma公司;ALT、AST試劑盒購自于中生北控科技股份有限公司;TNF-α、IL-4、IL-6試劑盒購自于北京華英生物技術(shù)研究所;PPARγ抗體及 NF-κB抗體購自于 abcam公司。

1.3 模型制備及分組 15只C57/BL6雄性小鼠予普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分成3組，予以造模及藥物干預(yù)。MCS組5只 (即空白對照組)，予以MCS飼料喂養(yǎng);MCD組5只(即模型組)，予以MCD飼料喂養(yǎng);姜黃素組5只 (姜黃素干預(yù)組)，予以MCD飼料喂養(yǎng);實驗動物自由攝食、飲水。

1.4 藥物干預(yù)及取材 造模即日起，姜黃素組予以姜黃素溶液0.1ml/10g灌胃，1次/d，選用DMSO作為溶劑;MCS組和MCD組均予以DMSO，0.1ml/10g灌胃，1次/d，連續(xù)兩周。姜黃素灌胃用藥劑量按實驗動物與人體體表面積比等效量核算比率，計算出小鼠的等效劑量為1.15g/kg。兩周藥物干預(yù)實驗結(jié)束，小鼠禁食水12小時后，稱重;乙醚麻醉;眼靜脈取血，分離血清，-80℃保存;肝臟稱重后部分液氮凍存，部分4%多聚甲醛固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 肝組織病理學檢測 小鼠肝組織冰凍切片，行常規(guī)油紅O染色;肝組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色。油紅O及HE切片光鏡下評估肝臟脂肪變性和炎癥活動情況。NASH的病理診斷標準采用“亞太地區(qū)非酒精性脂肪性肝病診斷與治療共識”推薦的美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理委員會2005年所定指南，根據(jù)其制定的NAFLD活動度積分(NAFLD Activity Score，NAS)進行評估。NAS組織學評分系統(tǒng)對14項病理改變，3項指標進行了半定量評估計分：肝脂肪變 (按發(fā)生脂肪變性實質(zhì)細胞/總細胞數(shù)，＜5%、5% ～33%、33% ～66%、＞66%，分別計0～3分)、小葉內(nèi)炎癥(按無病灶、＜2、2～4、＞4，分別計0～3分)、肝細胞氣球樣變 (按無、少量氣球樣細胞、較多/顯著氣球樣變，分別計0～2分)，其中NAS≥5分者可明確NASH的診斷，NAS＜3分則可排除NASH，兩者之間者為NASH可能。油紅O及HE切片使用Olympus攝像系統(tǒng)進行觀察和攝片。

1.5.2 血清生化指標檢測 按照試劑盒提供說明書操作，血清ALT、AST采用全自動生化分析儀進行測定。

1.5.3 血清放射免疫 (Radioimmunoassay，RIA) 檢測 按照試劑盒提供說明書測定血清中TNF-α、IL-4、IL-6水平。

1.5.4 Western blot檢測 肝組織NF-κB、PPARγ 蛋白表達進行了Western blot檢測：肝組織剪碎，置于勻漿器中，按10μl的裂解液/mg組織塊的比例加入單去污劑緩沖裂解液，在勻漿器中進行勻漿，裂解30分鐘后，將裂解液移至1.5ml離心管中，4℃，12000rpm離心5分鐘。取上清置于-20℃保存。配置BSA標準液，混勻后室溫放置兩分鐘，在分光光度計上比色分析，檢測樣品蛋白含量。配置凝膠，上樣，電泳。進行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移與膜的封閉，將濾紙和濾膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15分鐘，將濾膜放在平皿中，用1×麗春紅溶液于脫色搖床上輕搖，染膜5分鐘左右，然后用雙蒸水洗，將濾膜放在平皿中，封閉液室溫震搖1～2小時或4℃過夜。封閉結(jié)束后，將膜放入一塑料帶中，加入溶有一抗的新鮮配制的封閉液;4℃輕輕振搖兩小時，用封閉液清洗3次，每次10～15分鐘，以除去過量的一抗;將膜轉(zhuǎn)入另一塑料袋中，加入溶于封閉液的二抗;封口后室溫振搖孵育1～2小時;取出濾膜，用TBST漂洗3～5次，每次10～15分鐘，除去未結(jié)合的二抗。進行顯色反應(yīng)，凝膠圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用mean±SD表示 ，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計，顯著性檢測采用One-way ANOVA，對肝臟的病理學檢查結(jié)果采用等級資料的秩和檢測。統(tǒng)計學顯著性用雙側(cè)檢驗P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝臟外觀 MCS組小鼠肝臟外觀無腫脹增大，呈深紅色，有光澤，質(zhì)軟富有彈性，邊緣銳利，密度正常 (見插頁圖1A)。MCD組小鼠肝臟體積增大，質(zhì)量增加，呈黃色，薄膜緊張，邊緣鈍，彈性差，可見黃色脂肪斑，密度降低 (見插頁圖1 B)。姜黃素組小鼠肝臟體積及質(zhì)量較MCS組無明顯增加，呈淡紅色，可見組織間充盈淡黃色脂肪斑點，邊緣較鈍，彈性減弱。(見插頁圖1C)。

2.2 肝組織病理檢測結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：MCS組小鼠肝組織肝竇清晰可見，肝索排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常 (見插頁圖2A);MCD組小鼠肝組織肝充滿大量大小不一的脂肪空泡，肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂呈氣球樣變，炎性細胞浸潤明顯，呈灶狀分布，其中肝細胞損害主要集中在腺泡1區(qū)，炎性細胞以單核細胞、淋巴細胞為主 (見插頁圖2B);姜黃素組小鼠肝組織可見少量脂肪空泡，較MCD組比較明顯減少，少部分區(qū)域出現(xiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，偶見炎性細胞浸潤 (見插頁圖2C)。油紅O染色結(jié)果顯示：MCS組小鼠肝組織未見紅色脂滴 (見插頁圖2A);MCD組小鼠肝組織可見大量紅色脂滴，部分融合成片，表現(xiàn)為脂滴彌漫浸潤入肝細胞中，肝小葉內(nèi)含脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)約為20% ～45%(見插頁圖2B);姜黃素組小鼠肝組織可見局部散在紅色脂滴，成小顆粒狀，肝小葉內(nèi)寒脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)約為0.05% ～7%(見插頁圖2C)。

肝組織病理評分如圖3所示，MCD組肝組織NAS評分較MCS組顯著升高 (P=0.000)，總分＞5分，符合NASH組織學診斷，模型復(fù)制成功。姜黃素組NAS評分較MCS組升高(P=0.018)，與MCD組相比顯著下降，差異具有顯著性意義(P=0.000)。

圖3 各組小鼠肝組織H＆E和油紅O染色及病理評分

2.3 血清AST、ALT指標檢測結(jié)果 見表1。如表1所示，與MCS組相比，MCD組血清ALT(P=0.000)與AST(P=0.000)活性顯著增加;黃姜素組與MCS組比較，血清ALT(P=0.002)與AST(P=0.001)升高;黃姜素組血清 ALT水平較MCD組顯著下降 (P=0.000)，但與AST兩組間差異無顯著性意義。

表1 各組小鼠血清ALT與AST的檢測結(jié)果比較 (mean±SD，U/L)

2.4 血清TNF-α、IL-6、IL-4檢測結(jié)果比較 見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α水平檢測結(jié)果比較 (mean±SD)

如表2所示，MCD組血清TNF-α水平較MCS組升高 (P=0.000);姜黃素組血清TNF-α水平較MCD組明顯下降 (P=0.000)，且與MCS組差異無顯著性意義。MCD組血清IL-6水平較MCS組升高 (P=0.036);姜黃素組血清IL-6水平較MCD組顯著下降 (P=0.000)，且較MCS組有所下降 (P=0.028)。血清IL-4水平，3組之間差異無顯著性意義。

2.5 Western blot實驗結(jié)果

2.5.1 NF-κB 實驗結(jié)果 見圖 4。

圖4 各組小鼠肝組織NF-κB的表達

如圖4所示，MCD組小鼠肝組織NF-κB表達較MCS組明顯升高 (P=0.034)。姜黃素組NF-κB表達較MCD組顯著降低 (P=0.029)。

2.5.2 PPAR 檢測結(jié)果 見圖5。

圖5 各組小鼠肝組織的PPARγ表達

如圖5所示，MCD組小鼠肝組織PPARγ表達較MCS組顯著降低 (P=0.001)。姜黃素組PPARγ表達較MCS組顯著降低 (P=0.005)，與MCD組比較表達有所升高，但差異無顯著性意義。

3 討論

為了更明確的針對NASH進行研究，我們選用了MCD飲食誘導的動物模型，該模型是國際上公認的用于研究非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)中炎癥及纖維化的最好動物模型之一［6］。本研究前期試驗針對該模型進行了動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示MCD飲食誘導的NASH小鼠模型重復(fù)率高，造模2～3周時模型穩(wěn)定性最好［7］。本研究中動物模型肝臟外觀、病理評分、及血清ALT指標數(shù)據(jù)說明本研究成功復(fù)制了MCD飲食誘導的小鼠NASH模型。

本研究數(shù)據(jù)表明，經(jīng)兩周的干預(yù)性給藥，姜黃素可降低小鼠血清ALT、TNF-α、IL-6水平，明顯改善肝組織炎癥病理，在干預(yù)NASH中起到一定的抗炎作用。針對NASH相關(guān)的炎癥信號傳導通路，我們進行了進一步的研究。

NF-κB是一種具有多項轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，在炎癥和免疫反應(yīng)中起樞紐作用［8］。NF-κB在肝組織的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、肝細胞凋亡和再生中發(fā)揮重要作用［9］。NF-κB具有p50和p65兩個亞基，在靜息細胞中，NF-κB與抑制蛋白單體IκBα和IκBβ以無活性結(jié)合形式存于細胞質(zhì)。NF-κB活化后可誘導其他炎癥介質(zhì)基因表達，增強TNF-α、IL-lβ等細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，使其產(chǎn)生和釋放增多，相關(guān)細胞因子繼而再次激活 NF-κB，導致最初的炎癥信號進一步放大［10］。NF-κB在MCD飲食誘導的動物模型早期即可被激活，在該模型中發(fā)揮關(guān)鍵的促炎作用，促使模型向NASH發(fā)展［11］。

PPARγ作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，能與其特異性配體結(jié)合，進而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多種基因表達，參與脂肪細胞分化、糖脂代謝、炎癥與免疫等多種生理性效應(yīng)。有研究表明，PPARγ在脂肪性肝炎中起重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)作用，其可以降低促炎因子TNF-α、IL-6的生成。PPARγ基因缺失的小鼠喂食MCD飼料，與正常小鼠比較，發(fā)展成更嚴重的脂肪性肝炎［12］。PPARγ與配體結(jié)合并使之激活后，與視黃醛X受體α(retinoid X receptor α，RXRα)形成異二聚體，再結(jié)合于特異性DNA序列而使靶基因活化，此序列稱為PPAR特異性反應(yīng)元件 (peroxisome proliferator responsive element，PPRE)［13］。PPRE與NF-κB在脂肪肝和正常肝組織中作用相反，活性表現(xiàn)出抗炎機制，抑制脂肪肝炎癥的發(fā)展。PPARγ的抗炎信號途徑和 NF-κB的促炎信號途徑失衡可能導致脂肪肝炎癥的增加［2］。

本研究western blot試驗顯示，姜黃素可以抑制NF-κB的表達，而對PPARγ表達無明顯作用。由此我們可以得出結(jié)論，在NASH的炎癥信號傳導通路中，姜黃素單向作用于NF-κB的促炎信號傳導途徑，抑制NF-κB的表達，從而減少炎癥因子生成達到干預(yù)NASH的作用。而姜黃素對PPARγ的抗炎信號傳導途徑作用不明顯。姜黃素在NF-κB的信號傳導途徑中的具體作用靶點是我們下一步深入研究的重點。

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