張麗霞 劉近春 武 雯 李俊華 秦 濤

1.天津市公安醫(yī)院內(nèi)二科 (天津，300060) 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)是一種與胰島素抵抗(IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷。隨著肥胖和糖尿病患者的增多，NAFLD已成為西方發(fā)達(dá)國(guó)家慢性肝病的首要病因，并呈現(xiàn)出全球化發(fā)病的趨勢(shì)，在我國(guó)其亦發(fā)展成為僅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病。其中非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)不僅僅已成為繼丙型肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化之后隱源性肝硬化的重要原因之一，甚至是公認(rèn)的可以發(fā)展為肝纖維化和肝硬化甚至肝癌的一個(gè)病因。本研究觀察了NASH模型4周、8周大鼠血漿中 (TREM-1)水平的變化及其肝臟的病理學(xué)改變，旨在闡明TREM-1在NASH發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只 (由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重150～180ɡ。豬油自備;膽固醇 (南京建成生物工程研究所);鱟試劑定量檢測(cè)試劑盒 (廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司);ALT、AST試劑盒 (南京建成生物工程研究所);TNF-α試劑盒 (解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所);IL-6、IL-10試劑盒 (上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司);TREM-1 ELISA試劑盒 (上海麥莎生物科技有限公司);Hovapath TM型酶標(biāo)儀：BIO-RAD;Mistral 2000R低溫超速離心機(jī)：日本SANYO公司;UV-2102C型分光光度計(jì)：尤尼柯 (上海)儀器有限公司;OLYMPUSBH-2顯微照相系統(tǒng)：日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制作 參考邢凌翔非酒精性脂肪性肝炎模型的建立［1］，SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、模型組，每組12只。

1.2.2 動(dòng)物處理 于實(shí)驗(yàn)第 4周、8周末，禁食過(guò)夜，次日稱量體重后以1.0%戊巴比妥鈉 (3.0ml/100g體重，ip)麻醉，手術(shù)開(kāi)腹，在無(wú)菌無(wú)熱原條件下，分別從腹主動(dòng)脈、門(mén)靜脈采血5.0ml，離心4000轉(zhuǎn)/分，15分鐘，吸取上清液置 -70℃保存，待測(cè) TNF-α、AST、ALT、IL-6、IL-10、TREM-1及ET等;分離肝臟之后迅速?gòu)母斡胰~中部切取1小塊肝組織置于-70℃冷凍保存?zhèn)溆茫肊LISA方法檢測(cè)肝臟TREM-1;取部分肝右葉放于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，4μm切片，作HE染色后，在顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素ANOVA(方差分析)，相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肝臟TREM-1含量的變化 見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10含量的變化 見(jiàn)表2。

2.3 肝臟病理組織學(xué)改變 肉眼觀察，正常大鼠肝臟外觀呈紅褐色，有光澤，質(zhì)地柔軟而富有彈性，被膜光滑，邊緣銳利，切面光潔;光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞無(wú)明顯病變，核大圓居中，肝竇排列規(guī)則。模型組大鼠肝臟較正常組色澤暗淡，可見(jiàn)局部黃白色的變性灶，質(zhì)地較硬，體積明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面油膩。光鏡下所有模型組動(dòng)物均出現(xiàn)程度不同的彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，主要為小泡性脂肪變性。模型組所有標(biāo)本小葉內(nèi)均可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或散在的點(diǎn)狀或融合壞死，病變程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。

表1 4周、8周時(shí)各組大鼠肝臟TREM-1含量的變化

2.4 直線相關(guān)性分析 肝臟TREM-1和 TNF-α、IL-6、ET呈正相關(guān) (r值分別為 0.83，0.85，0.76，P ＜ 0.01); 與 IL-10負(fù)相關(guān) (r值為 -0.83，P ＜0.01)。

3 討論

從2000年國(guó)外研究人員［2］發(fā)現(xiàn)TREM以來(lái)，TREM受到越來(lái)越多的關(guān)注。TREM是一種新型的免疫球蛋白超家族炎癥觸發(fā)受體。人類TREM至少包括TREM-1和TREM-2這兩個(gè)激活受體和一個(gè)抑制受體TLT-1。而在小鼠體內(nèi)除了TREM-1和TREM-2外，還存在TREM-3。

TREM-1是TREM家族中較早被發(fā)現(xiàn)并被研究的一員，由于其在機(jī)體炎癥反應(yīng)中起到相當(dāng)重要的作用而一直受到廣泛的關(guān)注?？茖W(xué)家通過(guò)克隆TREM-1cDNA全長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，這種選擇性的表達(dá)于血液中的中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體是一種跨膜蛋白，它的胞外區(qū)由一個(gè)V型結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，胞漿區(qū)很短，僅有5個(gè)氨基酸組成，跨膜區(qū)包括一個(gè)帶正電荷的賴氨酸殘基［2］。新近研究發(fā)現(xiàn)TREM-1配體可能位于血小板表面，且與白細(xì)胞活性相關(guān)［3］。TREM-1的表達(dá)主要受細(xì)菌、真菌及細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)的調(diào)節(jié)。TREM-1在LPS等刺激下表達(dá)水平不僅升高而且有促進(jìn)炎性因子分泌的作用［2，4］，其與配體結(jié)合后能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、INF-γ等炎癥因子以及中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8、單核細(xì)胞趨化性蛋白 (MCP-1、MCP-3和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)蛋白MIP-1α;活化單核細(xì)胞表面CD40、CD86和CD54等共同刺激分子，還能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放髓過(guò)氧化物酶［2］和磷脂酶C酪氨酸磷酸化;可以使中性粒細(xì)胞迅速脫顆粒、呼吸爆發(fā)及吞噬作用，并能中和Toll樣受體激活后介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用［5］，從而導(dǎo)致“過(guò)度”炎癥反應(yīng)，最終可引起炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)、放大。

表24 周、8周時(shí)各組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10檢測(cè)值比較(±s)

表24 周、8周時(shí)各組大鼠血漿ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10檢測(cè)值比較(±s)

與同期對(duì)照組比較，*P＜0.05

時(shí)間 組別 ALT(IU/L) AST(IU/L) TNF-α(ng/ml) ET(EU/L) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml)4 周 對(duì)照組 (n=6) 73.05 ±5.09 31.13 ±1.24 1.11 ±0.03 0.04 ±0.01 27.96 ±5.81 32.71 ±2.34模型組 (n=6) 89.42 ±18.31* 50.99 ±6.73* 1.99 ±0.02* 0.06 ±0.01* 33.53 ±3.60 13.14 ±4.29*8 周 對(duì)照組 (n=6) 73.88 ±4.78 33.97 ±4.43 1.12 ±0.04 0.04 ±0.01 28.80 ±1.29 32.87 ±2.11模型組 (n=6) 92.86 ±1.51* 79.93 ±13.35* 2.08 ±0.03* 0.07 ±0.01* 38.51 ±5.33* 13.12 ±1.74*

在正常組織中，TREM-1選擇性的表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞表面，從而可以清除病原體、凋亡細(xì)胞和大分子物質(zhì)［6］。而且在浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞以及被感染的皮膚上皮細(xì)胞和被革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌或真菌感染的淋巴結(jié)中，TREM-1也均呈現(xiàn)出高表達(dá)現(xiàn)象［7］，TREM-1這種在細(xì)胞和組織中的分布特點(diǎn)提示它可能參與了炎癥反應(yīng)。之后的相關(guān)研究表明與健康人群相比，急性胰腺炎患者體內(nèi)TREM-1mRNA表達(dá)量不僅明顯增加，而且在炎癥的不同階段其表達(dá)量亦明顯不同，提示TREM-1與炎癥程度密切相關(guān)［8］;Detemann 等［9］人對(duì)細(xì)菌性腦膜炎患者進(jìn)行回顧性研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)TREM-1表達(dá)被上調(diào)，阻斷TREM-1可以消除LPS所引起的感染性休克［10］;急性內(nèi)毒素血癥時(shí)，肝巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也表現(xiàn)出TREM-1高表達(dá)的現(xiàn)象［11］，故TREM-1最初被認(rèn)為僅在急性炎癥時(shí)發(fā)揮作用，并且此觀點(diǎn)得到了普遍的認(rèn)可［7］。正常腸道單核巨噬細(xì)胞無(wú)TREM-1的表達(dá)，從而防止了腸道內(nèi)微生物引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)［12］，而Mirjam等［13］人經(jīng)動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)在慢性炎癥性腸疾病中TREM-1不僅呈現(xiàn)出高表達(dá)現(xiàn)象，而且和疾病的活動(dòng)性密切相關(guān)。后研究表明在肝臟慢性肉芽腫性炎、消化性潰瘍病及潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病等慢性炎癥疾病中 TREM-1的表達(dá)均表現(xiàn)為高水平狀態(tài)［13～15］，說(shuō)明TREM-1不僅參與急性炎癥反應(yīng)而且在慢性炎癥性疾病中也有著不可忽略的作用。

本實(shí)驗(yàn)鑒于上述思路設(shè)計(jì)了此次研究，在研究所得結(jié)果中發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，模型組大鼠TREM-1在4周時(shí)表達(dá)量即已明顯增高，8周時(shí)更加明顯，而且模型組TNF-α、IL-6、內(nèi)毒素 (ET)均明顯升高，IL-10表達(dá)量卻下降，說(shuō)明在此次的NASH模型中伴有腸源性內(nèi)毒素血癥 (IETM)的形成。相關(guān)分析顯示，TREM-1與ET、TNF-α、IL-6均呈正相關(guān)，而與IL-10呈負(fù)相關(guān)，提示TREM-1不僅可能通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎癥因子的高表達(dá)以及IL-10的低表達(dá)而參與NASH的發(fā)展，而且通過(guò)IETM可能也參與了NASH的發(fā)生以及對(duì)肝臟的損害，其機(jī)制可能是：IETM時(shí)，LPS經(jīng)Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR-4)識(shí)別后，通過(guò)TLR-4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活了NF-κB，促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)上調(diào)而抗炎因子IL-10表達(dá)下調(diào)，促炎介質(zhì)與抗炎介質(zhì)處于失平衡狀態(tài)，無(wú)法正常維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使得肝細(xì)胞受損，轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST表達(dá)升高。同時(shí)受LPS調(diào)節(jié)呈現(xiàn)高表達(dá)的TREM-1與接頭蛋白DAP-12偶聯(lián)后［16］，通過(guò)其介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的激活等將轉(zhuǎn)錄復(fù)合物激活，協(xié)同NF-κB促進(jìn)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，使得單核細(xì)胞分泌大量TNF-α、IL-6等促炎因子，而抗炎因子IL-10受抑制呈現(xiàn)低水平表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了促炎介質(zhì)與抗炎介質(zhì)之間的不平衡，加重了肝臟的損害。這樣在眾多細(xì)胞因子的共同作用下導(dǎo)致了肝細(xì)胞受損，在此過(guò)程中TREM-1與TLR-4通過(guò)協(xié)同作用共同介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，其中TREM-1主要是擴(kuò)大由TLR-4啟動(dòng)的炎癥反應(yīng)。

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