萬 丹，蔡 萍，張水寒*

（湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點實驗室，湖南省教育廳中藥粉體技術創(chuàng)新團隊，湖南 長沙 410013）

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌體干燥體，在我國具有悠久的藥用歷史。具有散血瘀、消堅結(jié)、解凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效。土鱉蟲水提液可以降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C并升高HDL-C和SOD水平，減少循環(huán)內(nèi)皮細胞(CEC)，維持NO和內(nèi)皮素(ET)平衡,對血管內(nèi)皮細胞起到了保護作用[1]。目前2010年版藥典還未收錄土鱉蟲含量測定方法。景晶[2]等建立的HPLC分析時間較長，劉麗芳[3]等用HPLC只測定出尿嘧啶的含量，未檢測出次黃嘌呤。本文建立了HPLC同時測定尿嘧啶、次黃嘌呤的含量，為評價土鱉蟲超微粉體內(nèi)在質(zhì)量提供一定的參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

島津LC-10ATVP高效液相色譜儀，配置SPDM10AVP型二極管陣列檢測器、CTO-10ASVP柱溫箱，CLASS-VP島津工作站；KQ3200型超聲波清洗器（220V，40KHz）； BFM-T6BI“貝利”微粉機（濟南貝利粉碎技術工程有限公司）；旋渦混合器（金壇市大地自動化儀器廠）；T-214型電子分析天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑

試劑均為分析純；對照品：尿嘧啶（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用批號：100469-200401）；次黃嘌呤（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號：140661-200903）；水為重蒸餾水。

1.3 藥材

10批土鱉蟲藥材分別購自四川、廣西、湖南、陜西、江西、安徽等地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院生藥鑒定室溫俊達副研究員鑒定為地鱉、冀地鱉及金邊土鱉蟲雌體。土鱉蟲經(jīng)貝利粉碎機粉碎后，加工成超微粉體。粒徑檢測采用Winner3001干粉激光粒度儀，結(jié)果D50均小于13μm，＜75μm的顆粒累積在95%以上。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil C18BDS柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為0.05 mol/L磷酸氫二銨水溶液，檢測波長為254 nm，流速為0.4 mL/min，柱溫為25℃。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品約1 g，精密稱定,置具塞錐形瓶中，加入 25 mL水，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，放至室溫，再稱質(zhì)量，補足減失的質(zhì)量，濾過，離心，吸取濾液過0.45μm微孔濾膜，備用。

2.3 對照品溶液的制備

分別稱取尿嘧啶、次黃嘌呤對照品5.5 mg、5.2 mg，分別加水制得濃度為22μg/mL尿嘧啶溶液及21μg/mL次黃嘌呤溶液。色譜圖見圖1。

圖1 土鱉蟲超微粉體HPLC圖譜

2.4 標準曲線的制備及線性關系考察

精密吸取尿嘧啶（22μg/mL）、次黃嘌呤對照品溶液（21 μg/mL）2、4、6、8、10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，以峰面積為縱坐標，進樣量（μL）為橫坐標，繪制標準曲線。

y=184 723x-16 842，r=0.999 5，線性范圍 0.044～0.220 μg；

y=196 570x-19 578，r=0.999 5,線性范圍 0.042～0.210μg

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下的尿嘧啶對照品溶液，連續(xù)重復進樣5次，計算各對照品色譜峰面積相對標準偏差，RSD為2.1%。

2.6 重復性試驗

取同一份樣品（湖南產(chǎn)，批號：20100803）6份按“2.2”項下方法制備，進樣測定，計算尿嘧啶、次黃嘌呤含量，RSD分別為2.2%、2.0%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下的同一份供試品溶液（湖南產(chǎn)，批號：20100803）， 分別在制備后 0、2、4、6、8、12、24 h進樣10μL，計算尿嘧啶、次黃嘌呤含量，RSD分別為2.5%、2.2%。

2.8 回收率試驗

取已知含量的（湖南產(chǎn)，批號：20100803）超微粉6份精密稱定，分別加入一定量的對照品，按“2.2”項下方法制備，進樣測定，計算回收率。結(jié)果表明，本方法加樣回收率較好。結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地土鱉蟲樣品，按“2.2”項下方法制備，平行操作，分別吸取對照品和供試品溶液各10μL，進樣分析，計算含量，見表2。

表1 加樣回收率測定結(jié)果（n=6）

表2 不同批次土鱉蟲超微粉體中尿嘧啶、次黃嘌呤的含量 （mg/g）

3 討論

色譜條件的選擇：比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二銨水溶液及0.05 mol/L磷酸氫二銨水溶液，因為土鱉蟲中尿嘧啶、次黃嘌呤為核苷類物質(zhì)，極性較大，在0.05 mol/L磷酸氫二銨水溶液，流速為0.4 mL/min，柱溫為25℃的條件下分離度最好。

從表2中結(jié)果可知，尿嘧啶、次黃嘌呤在冀地鱉、地鱉中含量高低不一，種內(nèi)差異達到3倍以上，本次實驗以河北產(chǎn)冀地鱉含量最高。金邊土鱉蟲并沒有收錄入2010年版藥典，但在我國福建、廣西、廣東等地多有養(yǎng)殖，且價格比地鱉、冀地鱉貴。本實驗收集了1批金邊土鱉蟲藥材，從實驗結(jié)果看，金邊土鱉蟲中尿嘧啶、次黃嘌呤的含量均不高。三種土鱉蟲中尿嘧啶、次黃嘌呤的含量是否有差別還有待進一步研究。

[1]于 燕，劉繼蘭，王菊英，等.土鱉蟲水提物對實驗性高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮和內(nèi)皮素的影響[J].中國生化藥物雜志，2003，24(1)：15-17.

[2]景 晶,曹 紅.HPLC法測定土鱉蟲中尿嘧啶和尿囊素的含量[J].藥學實踐雜志，2010,28(2)：134-136.

[3]劉麗芳,金蓉鸞,徐國鈞.HPLC法測定十種動物藥中尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、脲苷的含量[J].中國中藥雜志，1999,24(2)：73-76.