王紅梅 戴紀剛

線粒體是真核細胞的重要細胞器，作為細胞的“動力工廠”，它在細胞的能量代謝和氧自由基生成過程中扮演重要角色。同時，線粒體也是細胞凋亡調(diào)控的關鍵元件，這些細胞器收集并處理有關細胞代謝和信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)各方面的信號，決定著細胞的命運，參與了細胞死亡的執(zhí)行過程。能量代謝模式的轉(zhuǎn)換是癌細胞的重要特征。細胞在癌變過程中，將線粒體關閉，能量來源轉(zhuǎn)換為糖原酵解模式，同時線粒體啟動異常細胞凋亡的作用消失，這些細胞就可能“永生化”及癌變。線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）含量（即拷貝數(shù)）及氧化磷酸化相關酶活性的降低是腫瘤能量代謝發(fā)生改變的主要原因。為了解非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織中mtDNA的拷貝數(shù)是否發(fā)生改變并探討mtDNA拷貝數(shù)改變與NSCLC的相關性，本研究通過兩個單獨的實時熒光定量PCR對肺癌及相對應的癌旁組織mtDNA的含量進行了精確定量（拷貝數(shù)/細胞）。

1 材料與方法

1.1 病例資料 所用37例肺癌組織和37例癌旁肺組織均取自第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院2006年-2008年外科手術患者，均經(jīng)病理確診。癌旁肺組織標本為同一患者病灶遠端5 cm以上的正常肺組織，均經(jīng)組織學診斷，證實其沒有癌細胞。本組患者男性28例，女性9例，吸煙及曾經(jīng)吸煙者24例（吸煙者：每天吸煙10支以上且吸煙時間超過1年。本組中包括曾經(jīng)吸煙而現(xiàn)戒煙1年以上者9例），不吸煙者13例?；颊吣挲g30歲-75歲，中位年齡為55歲。組織學病理分型情況為：鱗癌23例，腺癌14例。

1.2 組織全基因組DNA提取 采用酚、氯仿、異戊醇抽提法提取全基因組DNA（包括mtDNA）。所得DNA溶于TE buffer（10 mM Tris±HCl, 1 mM EDTA, pH8.0），并用紫外分光光度計測定其波長260 nm時的吸光度（ OD260nm）值，計算DNA 濃度，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物及TaqMan探針 所有引物由上海基康生物技術有限公司合成、標記。本實驗中應用的熒光檢測物質(zhì)有FAM（6-Carboxy-fluorescein）和TAMRA（6-Carboxytetramethy-rhodamine），其中FAM作為報告基因（Reporter），標記在TaqMan探針的5'。TAMRA作為熄滅基因（Q uencdher），標記在TaqMan探針的3'。TaqMan探針與目的基因的結(jié)合部位在兩個引物之間。用于擴增人mtDNA D-loop HV1（Hipervariable region 1, HV1）和核β-globin基因的引物及TaqMan探針見表1。

1.4 線粒體HV1和核β-globin基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測

1.4.1 實時熒光定量PCR標準品的制備

1.4.1.1 HV1和β-globin基因片段的PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，終濃度為：Taq酶2 U，MgCl22.5 mmol/L，dNTP各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，模板DNA約100 ng 。反應條件：94oC預變性5 min，其余40個循環(huán)94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、1 min，最后72oC延伸10 min。

1.4.1.2 PCR擴增產(chǎn)物的克隆 用TaKaRa公司的試劑盒對PCR樣品進行純化后，分別將128 bp HV1和110 bp β-globin擴增產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體（TaKaRa公司），篩選含有插入片段的載體，以JM109感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化。用質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司）提取質(zhì)粒。

1.4.1.3 質(zhì)粒的鑒定與測序 將部分所提取的質(zhì)粒經(jīng)過PCR和序列測定進行鑒定，測序反應由上?；瞪锛夹g有限公司完成 。

1.4.1.4 質(zhì)粒濃度測定及拷貝數(shù)換算 紫外分光光度計檢測其OD260值。質(zhì)粒濃度（ng/μL）=OD260×50 μg/mL×稀釋終體積（mL）×1,000/稀釋時加入的原始溶液體積（μL）。質(zhì)?？截悢?shù)（Copies/μL）=質(zhì)粒濃度（ng/μL）×6.02×1014/660×堿基數(shù)（載體+插入片段）。

1.4.1.5 標準品的梯度稀釋 以無菌去離子水10倍比梯度稀釋HV1和β-globin質(zhì)粒分別獲得濃度為1×103-1×107拷貝/μL的制備定量PCR標準曲線的模板。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測

1.4.2.1 PCR反應 25 μL體系中含ABI TaqMan 1×PCR Master mix、3.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、熒光探針50 nmol/L、模板各2.0 μL 。每次檢測設置3個NTC（no template control）。每個樣品進行3個平行樣實驗。

1.4.2.2 PCR反應條件 50oC、2 min，95oC、10 min；然后95oC、15 s，60oC、30 s，共50個循環(huán)。TaqMan PCR Core試劑盒、光學PCR管、7700型PCR儀均為PE公司產(chǎn)品。

1.4.2.3 HV1和β-globin標準曲線繪制 將不同梯度濃度的標準品，與待測樣品同時進行定量PCR擴增，繪制標準曲線。

1.4.2.4 mtDNA拷貝數(shù)的檢測 通過兩個單獨的實時熒光定量PCR分別對待測樣本中線粒體HV1和核β-globin基因進行定量。以mtDNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標記。mtDNA的含量，即相對拷貝數(shù)/二倍體核基因組（diploid nuclear genome）=2×HV1/β-globin[1]。

1.5 統(tǒng)計學方法 計量資料以Mean±SD表示，使用SPSS 11.0統(tǒng)計學分析軟件進行t檢驗和線性回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆質(zhì)粒的鑒定 提取經(jīng)篩選的用于制作標準曲線模板的質(zhì)粒，經(jīng)過PCR及序列測定證實，HV1和β-globin基因PCR片段已分別連接至PMD18-T載體上，并用所建立的實時熒光定量PCR檢測，可見有明顯的熒光信號。

2.2 標準曲線的制備 根據(jù)不同濃度的標準品測得的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（threshold cycle,Ct）值繪制標準曲線（圖1）。不同濃度標準定量的模板與Ct值呈直線相關。HV1和β-globin基因定量PCR標準曲線的相關系數(shù)分別為0.998和0.999，斜率分別為-3.159和-3.400。

2.3 肺癌mtDNA拷貝數(shù)的改變 為了解肺癌組織中mtDNA含量的改變，我們通過兩個單獨的實時熒光定量PCR，對肺癌及相對應的癌旁肺組織mtDNA含量進行了精確定量（拷貝數(shù)/細胞）。線性回歸分析表明，肺組織mtDNA拷貝數(shù)和相對應的正常肺組織mtDNA拷貝數(shù)之間有相關性（r=0.589, P＜0.01）（圖2）。肺癌組織mtDNA的平均拷貝數(shù)/細胞為395±125，而相對應的正常肺組織為733±196，前者明顯低于后者（P＜0.001）。

2.4 肺癌mtDNA拷貝數(shù)改變和臨床指標的相關性 根據(jù)患者性別、年齡、是否吸煙、病理類型，我們將37例樣本進行分組。統(tǒng)計結(jié)果顯示，肺癌mtDNA拷貝數(shù)的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型無關（P＞0.05）（表 2）。

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圖1 mtDNA HV1（圖1A，圖1B）和核基因（圖1C，圖1D）實時熒光定量PCR動力曲線圖和標準曲線Fig 1 Amplification plots and standard curves of real-time PCR for Mitochondrial DNA HV1 (Fig 1A,Fig 1B) and nuclear β-globin gene (Fig 1C, Fig 1D)

圖2 肺癌及相對應的癌旁肺組織mtDNA 拷貝數(shù)散點圖及線性相關分析Fig 2 MtDNA copy number in lung cancinoma and adjacent nomal samples

表2 肺癌線粒體DNA拷貝數(shù)的改變和臨床指標的關系Tab 2 MtDNA copy number per nucleus in relation to clinicopathological variables in lung cancer

3 討論

哺乳動物mtDNA是一全長為16.5 kb左右的雙鏈閉環(huán)分子。它含有37個基因和一個非編碼區(qū)（控制區(qū)），非編碼區(qū)又稱之為D環(huán)（displace loop, D-loop），其內(nèi)有控制mtDNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序列。人類mtDNA D-loop的起始和結(jié)束位置分別為mtDNA的16,023和576核苷酸處，長度為1,122 bp。mtDNA兩條互補鏈的堿基組成呈非對稱性。一條鏈稱重鏈，富含G堿基，編碼37個線粒體基因中的28個。另一條鏈稱輕鏈，G堿基較少，編碼其余的線粒體基因。與核不同的是，線粒體基因組為多拷貝基因組。體細胞中平均含有100個-500個線粒體，而每一個線粒體中又含有1個-15個mtDNA分子。呼吸鏈的正常組合和運轉(zhuǎn)需要一個完整和功能性的線粒體基因組，而mtDNA功能的完成既依賴于每一個mtDNA分子結(jié)構(gòu)的完整性，也同時依賴于細胞中mtDNA的拷貝數(shù)。

大多數(shù)實體性腫瘤中，能量代謝的改變和mtDNA含量有著密切的聯(lián)系。Meierhofer等[1]研究表明腎癌組織中mtDNA含量和酶活性顯著低于癌旁組織，并且兩者的下調(diào)呈一致性。Mambo等[2,3]發(fā)現(xiàn)80%的乳腺癌組織其mtDNA拷貝數(shù)低于相應的正常組織。研究[4]表明線粒體酶活性的降低與腫瘤的類型和分化程度密切相關。目前還在肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤及腫瘤細胞株中發(fā)現(xiàn)存在有mtDNA含量的降低[5]。在本研究中，我們對NSCLC及相對應的癌旁正常肺組織mtDNA拷貝數(shù)進行了精確定量（拷貝數(shù)/細胞），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織mtDNA的平均拷貝數(shù)/細胞低于相對應的癌旁正常肺組織。但我們并沒有觀察到mtDNA拷貝數(shù)的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型之間的相關性。由此我們可以推論，mtDNA拷貝數(shù)量的改變與NSCLC的發(fā)生有密切關系，與患者性別、年齡、是否吸煙等因素無關；但NSCLC與小細胞肺癌之間是否有差異性則無法判斷。這與Matthew等[6]的研究結(jié)果具有一致性。

研究表明腫瘤的發(fā)生與細胞凋亡異常密切相關，而線粒體途徑是介導細胞凋亡的經(jīng)典途徑之一。一些環(huán)境因素的改變或者有害物質(zhì)的入侵，可造成線粒體腫脹破裂或多個線粒體融合成一個大線粒體，影響呼吸鏈電子傳遞，造成細胞死亡。這些都表明線粒體在腫瘤的發(fā)生過程中具有重要作用。我們檢測到肺癌組織中mtDNA的含量低于癌旁正常組織，表明mtDNA拷貝數(shù)降低可能導致肺癌細胞凋亡減少，從而促進了肺癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。

由于腫瘤細胞線粒體在分子、生化、代謝和遺傳水平上明顯區(qū)別于正常細胞，惡性腫瘤組織氧化抑制抑制酵解的現(xiàn)象減弱甚至消失，而代之以酵解抑制氧化，此即Crabtree效應。我們實驗測得正常肺組織mtDNA平均拷貝數(shù)/細胞為733±196，低于骨骼肌細胞中的1,811±546[7]和心肌細胞中的6,970±920拷貝數(shù)/細胞[8]，這與肺組織細胞能量代謝和有氧ATP生產(chǎn)的需求低于骨骼肌和心肌細胞的特點是一致的。臨床研究調(diào)查表明肺腫瘤的發(fā)生率遠遠大于骨骼肌和心肌腫瘤的發(fā)病率。由此我們可以推論，mtDNA含量低的組織細胞更易適應糖酵解供能的生長模式，從而發(fā)生腫瘤的幾率更高。

研究[9]發(fā)現(xiàn)線粒體特異性的抑制劑處理和mtDNA的部分減損，可通過某個應激信號而誘導肺癌A549細胞系出現(xiàn)侵襲性腫瘤表型；mtDNA缺失細胞系HeLa rho0細胞對阿霉素和光動力性療法（photodynamic therapy）誘導的細胞死亡具有極端的耐受性，而HeLa rho+細胞卻非常敏感[10-12]；這表明mtDNA含量降低不僅與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關，還關系到腫瘤的治療和預后，NSCLC中mtDNA含量較低可能是其化療敏感性差的原因之一。

目前我們的研究結(jié)果表明mtDNA含量降低可能與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療和預后具有密切關系。但引起這一變化的原因和具體機制還不清楚。我們將進一步探索研究，以期能為NSCLC的治療提供更多理論基礎。