王曄愷 周吉航 曾芳 黃燕燕 周世權(quán) 劉曉光

緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1, ZO-1）是一種與緊密連接有關(guān)的蛋白，參與維持和調(diào)節(jié)上皮屏障功能，常作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)，如血腦屏障[1]、腸上皮細(xì)胞[2]等。為探討ZO-1與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）臨床及病理特性的關(guān)系，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot、免疫組化檢測(cè)101例NSCLC患者癌組織和癌旁組織的ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)，探討其與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 收集舟山醫(yī)院2006年1月-2008年2月101例NSCLC患者（包括腺癌41例，鱗癌43例，細(xì)支氣管肺泡癌17例）癌組織和癌旁組織（距離癌組織2 cm）標(biāo)本，男性65例，女性36例，年齡（42-80）歲，平均年齡（61.20±8.51）歲。以61例肺部良性病變?yōu)閷?duì)照（炎性假瘤33例，機(jī)化性肺炎18例，支氣管擴(kuò)張8例，結(jié)核球1例，錯(cuò)構(gòu)瘤1例），男性40例，女性21例，年齡（41-82）歲，平均年齡（67.37±11.02）歲。診斷均經(jīng)病理切片確認(rèn)，置液氮罐中保存，取材為病理切片完成后所留組織，經(jīng)舟山醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者同意。

1.2 儀器和試劑 兔抗人ZO-1一抗購(gòu)自Zymed Labs（WB和IHC通用型），兔抗人GAPDH一抗購(gòu)自Abcam，SP-9000免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋，細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PVDF膜、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自碧云天，Trizol購(gòu)自Invitrogen，pMD18載體試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（Syber Green I）購(gòu)自Takara，熒光定量PCR引物（S: Sense; A: Antisense）：ZO-1-S：5'-GAGATGAACGGGCTACGC-3'，ZO-1-A：5'-GAGACTGCCA TTGCTTGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物230 bp；GAPDH-S：5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3'，GAPDH-A：5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物148 bp；均由上海生工合成，熒光PCR儀為Roche Lightcycle，圖像采集系統(tǒng)為Olypus-BX60，凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司Universal Hood II型，凝膠成像分析軟件為Quantity One，勻漿器為德國(guó)IKA T10 basic型。

1.3 ZO-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 ZO-1和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 Trizol提取總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，反應(yīng)體系25 μL：其中DNA模板3 μL，10 μmol/L ZO-1或GAPDH熒光定量PCR引物各1 μL，5×PCR緩沖液5 μL，加去RNA酶水補(bǔ)至25 μL，反應(yīng)條件：95oC、5 min；94oC、30 s，53.7oC、30 s，72oC、1 min，30個(gè)循環(huán)；72oC、10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片段4.5 μL、pMD18-T載體0.5 μL，低速離心后于16oC連接過(guò)夜，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養(yǎng)過(guò)夜，抽提其質(zhì)粒通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性重組子，送上海生工公司測(cè)序確證。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將重組質(zhì)粒10倍4梯度稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)cDNA進(jìn)行Syber Green I熒光染料嵌合法檢測(cè)，反應(yīng)體系參照試劑說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)條件：95oC、5 min；94oC、30 s，53.7oC、30 s，72oC、60 s，40個(gè)循環(huán)；72oC、10 min，利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)樣品中的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行定量，肺組織中ZO-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為ZO-1基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

1.4 Western blot檢測(cè)ZO-1蛋白表達(dá)

1.4.1 肺組織蛋白提取 預(yù)冷PBS洗滌組織2次，將肺組織剪碎，勻漿，加入適量含PMSF的RAPI裂解液，冰上裂解30 min，4oC下12,000 rpm離心15 min，取上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝后-80oC保存。

1.4.2 Western blot 分別取總蛋白上清液24 μL，加6 μL 5×上樣緩沖液混勻。用普通PCR儀煮沸10 min變性后取30 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白（12%分離膠，5%濃縮膠），轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（300 mA, 30 min），5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2 h，按照蛋白質(zhì)Marker切割PVDF膜，并分別加入1:2,000稀釋的兔抗人ZO-1多克隆抗體和1:500稀釋的兔抗人GAPDH多克隆抗體，4oC過(guò)夜。PBS-T洗滌3次，每次10 min。再分別加入1:5,000稀釋的羊抗兔IgGHRP，室溫震搖1 h，PBS-T洗滌3次，每次15 min。ECL系統(tǒng)顯色，凝膠成像儀檢測(cè)，采用Quaintity One分析軟件進(jìn)行條帶分子量及灰度值的分析。

1.5 ZO-1免疫組化 石蠟切片脫蠟水化后，PBS洗3遍，3%H2O2浸泡切片10 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波熱處理（98oC, 10 min）修復(fù)抗原，切片置于濕盒中，小牛血清常溫孵育1 h封閉非特異性抗原，吸取封閉液，加兔抗人ZO-1一抗（1:100稀釋），4oC孵育過(guò)夜，孵育結(jié)束后吸去一抗，PBS-T洗片3次，加人HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1:200稀釋），室溫下孵育30 min，孵育結(jié)束后吸去二抗，PBS-T洗片3次，滴加DAB顯色3 min-5 min，自來(lái)水沖洗切片終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染30 s，常規(guī)脫水、封片放干過(guò)夜，棕褐色為陽(yáng)性著色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。顯微鏡下攝片，用Imagepro-Plus 6.0進(jìn)行積分光密度值（integral optical density, IOD）測(cè)定并計(jì)算平均光密度（average of the optical densities, AOD），選定組織區(qū)域，通過(guò)AOD測(cè)定ZO-1蛋白的表達(dá)，其值越大，表達(dá)量越高。

1.6 生存隨訪 2年后采用記錄在案的電話隨訪101例肺癌患者本人或家屬，有6例失訪，在訪的95例患者中44例死于肺癌復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移引起的疾病，未有非正常死亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，用t檢驗(yàn)單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者癌組織、癌旁組織和肺良性病變肺組織中ZO-1 mRNA和蛋白 ZO-1 mRNA在癌組織、癌旁組織、肺良性病變肺組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.47、1.10±0.55、1.24±0.39，肺癌組織與肺良性病變肺組織之間比較具有顯著性差異（P＜0.01）。ZO-1蛋白在癌組織、癌旁組織、對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.45±0.31、0.75±0.26、0.87±0.39，癌組織和對(duì)照組之間、癌組織和癌旁組織之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），癌旁組織和對(duì)照組之間的差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 NSCLC患者癌組織和癌旁組織不同臨床及病理因素中ZO-1 mRNA的表達(dá) 癌旁組織ZO-1 mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.07,P＜0.01），2年生存組和2年死亡組中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.61,P＜0.01）；癌組織中ZO-1 mRNA在2年生存組和2年死亡組的差異存在明顯差異（t=3.81,P＜0.01）（表1）。

2.3 ZO-1蛋白在NSCLC患者肺組織中的免疫組化結(jié)果 在癌旁（圖中為腺癌癌旁）和對(duì)照組織中，ZO-1沿著肺泡壁均勻分布；在癌組織中（圖中為腺癌組織），ZO-1也沿著腺泡壁分布，但不完整，存在部分位置的缺失，腺癌細(xì)胞間的ZO-1呈低表達(dá)。ZO-1平均光密度在癌組織、癌旁組織和對(duì)照組中分別為69.55±17.13、246.39±83.15、330.93±72.44，組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

3 討論

ZO-1屬于膜鳥(niǎo)苷酸激酶MAGUK（membranceassociate guanylate kinase homologs, MAGUK）家族[3]，與ZO-2、ZO-3組成ZO-1/ZO-2/ZO-3復(fù)合體，該復(fù)合體有3個(gè)PDZ區(qū)，ZO-1通過(guò)其PDZ區(qū)與其它細(xì)胞連接蛋白如肌動(dòng)蛋白[4]等相互連接。本研究通過(guò)將ZO-1和GAPDH構(gòu)建到T載體作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Syber Green I熒光染料嵌合法檢測(cè)ZO-1和GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)含量，通過(guò)檢測(cè)顯示癌組織中的ZO-1 mRNA和蛋白均低于對(duì)照組（P＜0.01）。由于ZO-1具有正常上皮細(xì)胞標(biāo)志物的特性[5]，因此其mRNA的降低可能是肺癌早期發(fā)生的指標(biāo)之一，這點(diǎn)在其它多種癌組織中已有報(bào)道： Fiorini等[6]發(fā)現(xiàn)化學(xué)藥物DDT作用于ZO-1等影響到細(xì)胞耦合損傷，并推測(cè)可能在癌變中起作用；Orban等[7]通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌中出現(xiàn)ZO-1 mRNA相對(duì)于正常肝的表達(dá)降低?？梢?jiàn)，ZO-1除了粘附和屏蔽功能外，還參與細(xì)胞耦合功能構(gòu)建，其參與構(gòu)建的緊密連接束（tight junction srtands, TJs）對(duì)上皮屏障功能有重要影響[8]。目前有報(bào)道證實(shí)，多種物質(zhì)如糖原合酶激酶-3[9]、胰島素樣生長(zhǎng)因子[10]等可通過(guò)作用于ZO-1影響TJs的構(gòu)建或屏障功能。從免疫組化的結(jié)果來(lái)看，癌細(xì)胞間的ZO-1表達(dá)大量缺失，可能影響到癌組織中TJs的構(gòu)建，使得肺部微環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的原位增殖。

表1 NSCLC患者癌組織和癌旁組織不同臨床及病理因素中的ZO-1 mRNA的表達(dá)Tab 1 Expression of ZO-1 mRNA in different clinicopathologic parameters and the survial rates in carcinoma tissue and adjacent tissue of the patients with NSCLC

圖1 肺癌患者癌組織、癌旁組織和對(duì)照組中ZO-1蛋白表達(dá)。A：Wester blot檢測(cè)ZO-1表達(dá)；B：柱狀分析圖表明ZO-1表達(dá)在癌組織、癌旁組織和對(duì)照組中的差異存在明顯差異；泳道1-2： 癌旁組織；泳道3-4：對(duì)照組；泳道5-6：癌組織；*：與對(duì)照組相比，P＜0.05；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01；##：與癌旁組相比，P＜0.01。Fig 1 Expression of ZO-1 protein in carcinoma tissue group, adjacent tissue group and control group. A: Expression of ZO-1 protein determined by Western blot; B: The densitometric analysis reveal that the levels of ZO-1 protein among the carcinoma tissue group, the adjacent tissue group and the control group were with significantly statistic difference; Lane 1-2:adjacent tissue group; Lane 3-4: control group; Lane 5-6: carcinoma tissue group; *: compared with the control group, P＜0.05; **: compared with the control group, P＜0.01; ##: compared with the adjacent tissue group, P＜0.01.

圖2 NSCLC患者肺組織中ZO-1免疫組化。A：ZO-1在肺組織中的免疫組化（SP，×20）；B：柱狀分析圖表明ZO-1表達(dá)在癌組織、癌旁組織和對(duì)照組中的差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**：與對(duì)照組相比，P＜0.01；##：與癌旁組相比，P＜0.01。Fig 2 Immunohistochemical assessmen of ZO-1 in lung tissue of patients with NSCLC. A: Immunohistochemical assessmen of ZO-1 in lung tissue(SP, ×20). In adjacent tissue of gland cancer and control group, ZO-1 distributed through the alveolar walls completely. But in carcinoma tissue of gland cancer, ZO-1 distributed through the alveolar walls incompletely; there is a low expression of ZO-1 between the gland cancer cells; B: The densitometric analysis reveal that the averages of the optical densities of ZO-1 protein among the carcinoma tissue group, the adjacent tissue group and the control group were significant statistic different; **: compared with the control group, P＜0.01; ##: compared with the adjacent tissue group, P＜0.01.

本研究還發(fā)現(xiàn)，在NSCLC癌組織中淋巴結(jié)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移組中的ZO-1 mRNA未存在明顯差異（P＞0.05），但兩者在癌旁組織中卻存在明顯差異（P＜0.01），這可能是由于ZO-1主要表達(dá)于胞膜和細(xì)胞間質(zhì)[11]，而肺組織淋巴系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞間連接是由ZO-1等一系列緊密連接蛋白構(gòu)建，ZO-1的低表達(dá)降低了周圍微循環(huán)組織內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接性，影響其柵欄屏障功能和免疫細(xì)胞的分布[12]，從而更有利于癌細(xì)胞通過(guò)通透性增高的組織擴(kuò)散進(jìn)入淋巴系統(tǒng)[13]。Tuomi等[14]發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Cepsilon調(diào)控alpha 5-ZO-1復(fù)合體控制肺癌細(xì)胞遷移片層的形成。Zen等[15]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌患者組織中PARD3基因的低表達(dá)可干擾ZO-1的胞間位置，并和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。Ohtani等[16]在胃癌中發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白Claudin-4、ZO-1與腫瘤侵襲性存在相關(guān)性。但是癌組織中ZO-1 mRNA在是否侵犯胸膜組別中卻無(wú)明顯差異，這可能是癌細(xì)胞在肺組織內(nèi)擴(kuò)散和淋巴轉(zhuǎn)移略有不同，實(shí)體組織內(nèi)腫瘤擴(kuò)散不但和腫瘤侵襲性及肺內(nèi)部微環(huán)境等有關(guān)，還和癌組織原發(fā)部位及病程長(zhǎng)短有關(guān)。癌組織中ZO-1 mRNA在2年內(nèi)死亡組和2年生存組中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且癌旁組織中也存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這意味著癌組織和癌旁組織中ZO-1 mRNA可能是一個(gè)和MA-15-5抗原[17]類似并與NSCLC 2年生存率密切相關(guān)的指標(biāo)，但是否能作為臨床預(yù)后的決定性因素，還需要進(jìn)一步研究。