李莎莎 張義軍 李洪利 丁保清

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中常見，占其總數(shù)的80%-85%，主要包括鱗癌（squamous cell carcinoma, SCC）、腺癌（adeno carcinoma,AC）和大細(xì)胞癌（large cell cancer, LCC）3種亞型。隨著近10年來在腫瘤診斷、手術(shù)、放化療等方面的研究取得的一些進(jìn)步，乳腺癌、前列腺癌等患者的5年生存率得到明顯提高，但NSCLC患者的5年生存率仍較低，在發(fā)展中國家不足9%。

甲硫腺苷磷酸化酶（methylthioadenosine phosphorylase, MTAP）是嘌呤和甲硫氨酸合成補(bǔ)救途徑中的一個關(guān)鍵酶，催化MTA生成ATP、dAMP和甲硫氨酸，參與細(xì)胞的能量合成與蛋白合成。MTAP在正常細(xì)胞和組織中表達(dá)豐富，但在多種惡性細(xì)胞系和腫瘤組織中都存在高頻缺失或降低。有文獻(xiàn)[1]報道，MTAP在NSCLC中存在純合性缺失。本研究通過檢測NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中MTAP的表達(dá)水平，結(jié)合臨床資料探討NSCLC中MTAP的表達(dá)變化及與其臨床病理特征的關(guān)系，并為NSCLC的臨床診斷、治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗標(biāo)本 原發(fā)NSCLC患者52例，2008年1月-2009年12月于濰坊市人民醫(yī)院和濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行外科手術(shù)治療，收集手術(shù)時切下的新鮮標(biāo)本。根據(jù)所取組織分為NSCLC組、癌旁組（距癌邊緣2 cm）、邊緣組（距癌邊緣5 cm以上的邊緣肺組織），手術(shù)切除的新鮮組織以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-70oC冰箱保存。其中男性39例，女性13例；年齡43歲-72歲，中位年齡60.8歲；有吸煙史者38例，無吸煙史者14例；鱗癌28例，腺癌24例；高-中分化40例，低分化12例。所有病例術(shù)前均未采取放療、化療和免疫治療?；颊呔橥狻?/p>

1.1.2 主要試劑 Trizol? Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Invitrogen公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物有限公司；兔抗人MTAP多克隆抗體購自武漢三鷹生物有限公司；SP免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測MTAP的表達(dá) 所有組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每個蠟塊行5 μm厚連續(xù)切片，HE染色。觀察組織病理結(jié)構(gòu)，由病理科醫(yī)師做出診斷，且癌旁組未見癌細(xì)胞。應(yīng)用免疫組化SP法染色：以PBS代替一抗為陰性空白對照，已知結(jié)腸癌陽性切片為陽性對照；切片組織常規(guī)脫蠟入水后，微波抗原修復(fù)10 min，一抗孵育4oC過夜，DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染。

1.2.2 圖像分析 在顯微鏡相同光強(qiáng)度下，數(shù)碼相機(jī)關(guān)掉自動白平衡等功能，拍攝圖片（×200）。每例組織切片隨機(jī)采取5個視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）專業(yè)圖像分析軟件對所采集的圖片進(jìn)行圖像分析，選取AOI計算平均光密度（mean optical density, MOD）值，并在同一參數(shù)條件下對所有圖片進(jìn)行MOD值分析。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測MTAP mRNA Trizol試劑盒提取NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Gene Bank中MTAP的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計引物序列，實(shí)時熒光定量PCR檢測樣本中MTAP cDNA水平，β-actin基因做內(nèi)對照。引物：MTAP（292 bp）：上游引物5'-CGCTTGGTTCCCTTAGTC-3'，下游引物5'-GATGTTCGCCTGGTAGTT-3'；β-actin（314 bp）：上游引物5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'；下游引物5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。反應(yīng)在25 μL的體系中進(jìn)行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5 μL、10 μM的上下游引物各1 μL、樣本cDNA 2 μL （300 ng）、RNA酶滅活水8.5 μL。熱循環(huán)如下：94oC、5 min；94oC、30 s，57oC、30 s，72oC、60 s，40個循環(huán)；72oC、10 min。應(yīng)用2-ΔΔCt法[2]分析目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，計算NSCLC組織和癌旁組織中MTAP mRNA相對于邊緣肺組織的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用Mean±SD表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中MTAP的免疫組織化學(xué)檢測 各組肺組織切片MTAP蛋白免疫組織化學(xué)染色（圖1）胞漿著色，呈棕黃色或黃褐色顆粒狀。52例NSCLC組織中有3例MTAP陰性，49例MTAP陽性，陰性率為（5.8%），而在癌旁組織、邊緣肺組織中均有表達(dá)。圖像MOD值分析顯示，NSCLC組MTAP蛋白含量為0.275±0.142，癌旁組為0.495±0.059，邊緣組為0.501±0.028。統(tǒng)計學(xué)分析顯示NSCLC組的MTAP蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組和邊緣組（t分別為10.283、10.940，均P＜0.001），而癌旁組與邊緣組之間無明顯差異（t=0.694,P=0.491）。MTAP蛋白的表達(dá)與性別、年齡、吸煙史以及腫瘤的病理類型無明顯相關(guān)，但與腫瘤的分化程度有關(guān)（t=2.310, P=0.025）（表1）。

2.2 NSCLC組織、癌旁組織、邊緣組織中MTAP mRNA的表達(dá) 52例NSCLC組織、癌旁組織、邊緣肺組織中均有表達(dá)（圖2），以邊緣組作為對照組，MTAP mRNA相對表達(dá)量用以下公式計算：folds＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝（CtMTAP-Ctβ-actin）樣品組-（CtMTAP-Ctβ-actin）對照組，通過計算得出NSCLC組織相對于邊緣肺組織的表達(dá)量為0.029±0.016；癌旁組織相對于邊緣肺組織的表達(dá)量為0.117±0.060，統(tǒng)計學(xué)分析顯示NSCLC組織中MTAP mRNA相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織（t=9.902, P＜0.001）。

圖1 各組肺組織MTAP蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果（×200）。A、B：NSCLC組織中（鱗癌、腺癌）MTAP的陽性表達(dá)；C：NSCLC組織中MTAP的陰性表達(dá)；D：癌旁組織中MTAP的陽性表達(dá)；E：邊緣肺組織中MTAP的陽性表達(dá)。Fig 1 Immunohistochemical staining results for MTAP in lung tissue (×200). A: Positive expressions of MTAP in squamous cell carcinoma; B: Positive expressions of MTAP in ademo carcinoma; C: Negative expression of MTAP in NSCLC tissue; D: Positive expression of MTAP in paracarcinomous tissue; E: Positive expression of MTAP borderline lung normal tissue.

表1 MTAP在NSCLC組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（Mean±SD）Tab 1 The relationship between expression of MTAP and clinicopathological variables in NSCLC tissue (Mean±SD)

3 討論

MTAP基因定位于9p21，與CDKN2A、CDKN2B以及ARF臨近，該區(qū)域基因的缺失或超甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)的缺失。在惡性黑色素瘤[3]、蕈樣肉芽腫病[4]、腹膜間皮瘤[5]等發(fā)現(xiàn)，9p21的大片區(qū)域純合性缺失導(dǎo)致CDKN2A、ARF、MTAP失活，該部位的缺失與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[4]，并且CDKN2A、ARF參與細(xì)胞周期的調(diào)控[6]。但對于淋巴瘤的研究[7]發(fā)現(xiàn)MTAP是一種獨(dú)立于CDKN2A、ARF的抑癌基因。

圖2 各組組織中MTAP基因PCR產(chǎn)物電泳圖。M：DNA marker（DL 2000）；第1-5泳道：MTAP mRNA的表達(dá)；第6-10泳道：β-actin mRNA的表達(dá)；第1、2、6、7泳道：邊緣正常組織；第3、4、8、9泳道：癌旁組織；第5、10泳道：NSCLC組織。Fig 2 PCR analysis of MTAP mRNA in NSCLC tissue. Lane M: DNA marker (DL 2000); Lane 1-5: Expression of MTAP mRNA; Lane 6-10: Expressions of β-actin mRNA; Lane 1, 2, 6, 7: borderline normal tissue; Lane 3, 4, 8, 9: paracarcinomous tissue; Lane 5, 10: NSCLC tissue.

MTAP在多胺代謝以及腺嘌呤、甲硫氨酸的合成補(bǔ)救過程中發(fā)揮重要作用。MTAP催化MTA轉(zhuǎn)化為腺嘌呤、MTR1P，并最終生成AMP、甲硫氨酸。在MTAP陰性的腫瘤細(xì)胞中，嘌呤合成主要依靠從頭合成途徑。在體外研究中，Krasinskas等[8]發(fā)現(xiàn)5'-脫氧-5'-甲硫腺苷與腺嘌呤類似物聯(lián)合療法可以殺死MTAP陰性的A549肺癌細(xì)胞，而對MTAP陽性的人成纖維細(xì)胞無作用。這提示MTAP可以用于肺癌的選擇性化療。MTAP的底物MTA是氨丙基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶的有效抑制劑[9]。Steven等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MTAP基因缺失的黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)MTA四倍濃度的積聚，MTA介導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌基本的成纖維細(xì)胞生長因子（basis fi broblast growth factor, bFGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3, MMP3），并與黑素瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）活性上調(diào)有關(guān)，MTA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。通過比較基因組雜交[11]發(fā)現(xiàn)，156例胃腸道間質(zhì)瘤中有25例出現(xiàn)MTAP純合性缺失，并且這種缺失與腫瘤的大小、有絲分裂速度、Ki-67指數(shù)、危險水平均呈正相關(guān)。MTAP的這些生物學(xué)特點(diǎn)提示其可能參與細(xì)胞的增殖和分裂以及腫瘤的侵潤、轉(zhuǎn)移等，因此被認(rèn)為是腫瘤診斷和治療的新的分子靶點(diǎn)。本研究取材于NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織，以研究MTAP基因在NSCLC不同發(fā)展階段的表達(dá)情況及其相關(guān)性。免疫組化結(jié)果顯示，MTAP在NSCLC組織、癌旁組織以及邊緣肺組織中均有表達(dá)，但在NSCLC組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織以及邊緣肺組織，說明MTAP通過改變腫瘤細(xì)胞的生長代謝參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。

以往研究[12]表示，卵巢癌組織Western印跡檢測到的MTAP蛋白缺失率高于RT-PCR檢測到的MTAP mRNA的缺失率。本研究發(fā)現(xiàn)，通過免疫組織化學(xué)檢測有3例NSCLC組織出現(xiàn)MTAP蛋白缺失，而PCR檢測未發(fā)現(xiàn)MTAP mRNA的缺失，這種蛋白水平與基因水平檢測結(jié)果的不同有異于以往研究結(jié)果[13]。其原因可能是，DNA甲基化程度改變導(dǎo)致的基因漸生性沉默、組蛋白尾部的共價修飾以及染色質(zhì)變性，microDNA這些因素導(dǎo)致了實(shí)時定量PCR檢測實(shí)體瘤中MTAP缺失的局限性[14]，這些發(fā)現(xiàn)表示，在診斷NSCLC患者的MTAP表達(dá)缺失時，免疫組織化學(xué)優(yōu)于PCR。本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測到，在高-中分化的NSCLC組織中MTAP蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，說明MTAP不但與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且與腫瘤的惡性程度有關(guān)。在mRNA水平，NSCLC組織中MTAP基因相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，表明在NSCLC發(fā)展過程中存在MTAP基因在轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。MTAP蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙史以及腫瘤的病理類型無明顯相關(guān)，這也可能與樣本量有限相關(guān)，還需進(jìn)一步加大樣本量驗證MTAP在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)差異。