趙作濤 李麗麗 王曉陽 萬喆 陳偉 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，器官移植及導(dǎo)管技術(shù)的活躍開展，艾滋病和糖尿病的發(fā)病率的上升，免疫受損患者不斷增多，曲霉屬和毛霉目真菌感染的發(fā)病率呈急劇上升趨勢(shì)，是免疫受損患者，特別是造血干細(xì)胞移植、器官移植及腫瘤放化療患者的主要致死因素之一［1-2］。曲霉現(xiàn)已成為我國僅次于念珠菌的第二位條件致病性真菌，其感染死亡率高，如免疫受損患者發(fā)生侵襲性曲霉感染的病死率可高達(dá)90%;而毛霉目真菌的感染近年來也有不斷增多趨勢(shì)，特別在重癥糖尿病和器官移植患者發(fā)生的急進(jìn)性感染?？裳杆傥＜盎颊呱?-4］。曲霉屬和毛霉目真菌的臨床表現(xiàn)比較相似，但兩者對(duì)不同抗真菌藥物敏感性不盡相同，治療與預(yù)后也不同。因此，正確鑒別真菌的種類是提高治愈率的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)的真菌病原體診斷方法存在耗時(shí)久、敏感性和特異性低的缺陷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床早期特異診斷的需要。本研究使用靶向真菌的保守序列18S和28S rDNA區(qū)域的真菌通用引物，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，再根據(jù)具有種特異性序列特征的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)域設(shè)計(jì)具有種特異性的探針對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行反向線點(diǎn)雜交，擬鑒定曲霉屬和毛霉目真菌至種的水平［5-6］。并與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法、ITS區(qū)DNA測(cè)序方法鑒定結(jié)果比較，驗(yàn)證RLB方法的敏感性和特異性，擬為臨床快速鑒定和早期診斷曲霉屬和毛霉目真菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株 收集我院真菌與真菌病研究中心保藏的98株臨床分離菌株，其中包括煙曲霉15株、黃曲霉12株、黑曲霉11株、土曲霉15株、構(gòu)巢曲霉菌4株、凍土毛霉菌11株、總狀毛霉菌4株、卷曲毛霉菌5株、少根根霉5株、小孢根霉10株、微小根毛霉2株、傘狀犁頭霉4株，以及8株實(shí)驗(yàn)對(duì)照菌株，分別為白念珠菌、茄病鐮刀菌、尖端賽多孢菌、馬爾尼菲青霉、疣狀瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克銀漢霉各1株(見表1)。

試劑 EDAC，Sigma公司;Biodyne C尼龍膜，Pall公司;鏈親和素-過氧化物酶，Roche公司;化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(ECL)，Roche公司;X線片，Amersham公司。

表1 98株實(shí)驗(yàn)菌株的和8株對(duì)照菌株的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，ITS區(qū)序列分析與RLB鑒定結(jié)果Tab.1 Ninety-eight well-characterized fungal strains and 8 control stains identified by the conventional morphological methods，ITS senquence analysis and RLB assay

主要實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀，Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler，Eppendorf公司;Miniblotter，Immunetic公司;雜交箱，Thermo公司;暗盒，Amersham公司;測(cè)序儀，ABI PRISM 373 DNA sequencer;Labculture超凈工作臺(tái)，Esco公司;Incubator生化培養(yǎng)箱，Sanyo公司;臺(tái)式高速離心機(jī)，TGL-16G上海醫(yī)用分析儀器廠;瓊脂糖凝膠電泳儀，Mupid，Advance公司;凝膠成像儀，BIORAD公司。

1.2 方法

引物、探針的選擇與設(shè)計(jì) 引物和探針序列見表2。本研究使用的引物為真菌通用引物:ITS1和ITS4，長度為19～20 bp，退火溫度在55.75～61.88℃，擴(kuò)增片段大小在 600 ～700 bp。PCR的引物5＇末端使用生物素標(biāo)記，以便通過鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶底物結(jié)合來檢測(cè)。使用的探針為種特異性探針，為了能夠在一致的體系條件下雜交，探針設(shè)計(jì)成具有相似的物理特性;長度在 20～29 bp，退火溫度為 54.48～63.68℃ (見表2);使用Genbank中的序列進(jìn)行比對(duì)。所有的探針5＇末端用胺標(biāo)記以和尼龍膜共價(jià)鍵的結(jié)合，使探針在尼龍膜上條帶狀排列并且可以重復(fù)使用尼龍膜。

表2 本研究使用的引物和探針Tab.2 Oligonucleotide primers and probes used in this study

探針 AFUM、ANIG、ATER、ANID 引用文獻(xiàn)，AFLU在文獻(xiàn)所給探針的基礎(chǔ)上有所改造［7-8］;探針 MHEI、MRAC、MCIR、RAPP、RMIC、RPUS、ACOR由本課題研究者設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方法為:首先在NCBI上查找出所用的12株真菌的核糖體DNA序列(包括18S部分區(qū)域、ITS1區(qū)、5.8S、ITS2區(qū)和28S部分區(qū)域)，利用序列對(duì)比軟件DNAMEN對(duì)真菌的rDNA序列進(jìn)行對(duì)比，在ITS1或ITS2區(qū)找出每種真菌特異性序列，再引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5和Oligo 6對(duì)該段特異性序列進(jìn)行檢測(cè)，確保所設(shè)計(jì)的探針不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

所有引物5＇端生物素標(biāo)記、探針5＇末端用胺標(biāo)記、引物和探針合成及標(biāo)記均由Sangon公司完成。

探針標(biāo)記 為了優(yōu)化雜交的條件，我們?cè)谇捌诠ぷ骰A(chǔ)上將探針以0.6 μmol/L為起始濃度進(jìn)行倍比稀釋，選定的最適終濃度為0.6 pmol/L，標(biāo)膜的具體步驟見參考文獻(xiàn)［5-9］。

真菌DNA提取 我們?cè)谇捌诠ぷ骰A(chǔ)上，對(duì)氯化芐法進(jìn)行改良，具體操作詳見參考文獻(xiàn)［10-11］。

PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)總體積為25 μL，含模板 DNA 1 μL，10 × Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.25 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，引物 50 pmol/L 各 0.5 μL，Taq 酶 (5 U/μL)0.1 μL，補(bǔ)超純水至 25 μL。

PCR反應(yīng)條件 95℃ 15 min，擴(kuò)增變性、退火、延伸的條件分別為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖中電泳30 min后染色30 min，于凝膠成像系統(tǒng)照相，剩余的PCR產(chǎn)物用于RLB雜交。

雜交 RLB雜交的方法基于文獻(xiàn)報(bào)道及前期工作方法改良而成，具體步驟見參考文獻(xiàn)［5-9］。RLB的結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為:標(biāo)記有種特異性探針對(duì)應(yīng)的底片位置上，出現(xiàn)黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陽性。無黑點(diǎn)，表示結(jié)果為陰性。

RLB敏感性檢測(cè) 通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，將獲得的不同濃度的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繼之行RLB雜交，可以見到RLB雜交信號(hào)的最低濃度即為RLB的敏感性。

3種鑒定方法的比較 通過RLB雜交方法鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法，ITS區(qū)測(cè)序方法結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的敏感性和特異性。

2 結(jié) 果

2.1 真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

將實(shí)驗(yàn)所用的臨床分離菌株標(biāo)本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，觀察菌落的形態(tài)和顏色，并在鏡下觀察真菌分生孢子頭或孢子囊的形態(tài)、菌絲橫徑、分枝、有無橫隔，可以對(duì)真菌進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定，見表1。

2.2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

98株實(shí)驗(yàn)菌株均能用真菌通用引物擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，目的片段與預(yù)期一致，600～700 bp大小(見圖1)。

2.3 DNA 測(cè)序結(jié)果

98株菌臨床分離株得到良好的測(cè)序結(jié)果，與GenBank和CBS的菌種基因序列庫比對(duì)后，得到相應(yīng)的比對(duì)結(jié)果(見表1)。

2.4 RLB 結(jié)果

本研究選取的98株實(shí)驗(yàn)菌株中，均能夠通過利用自主設(shè)計(jì)的種特異性探針檢測(cè)出結(jié)果，相互之間并無交叉反應(yīng)(見圖2)。本研究所用的98株臨床分離株RLB結(jié)果見表1。對(duì)于98株臨床分離株，RLB鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)真菌鑒定方法 (真菌培養(yǎng)及鏡檢)、DNA測(cè)序結(jié)果完全一致。8株對(duì)照菌株，分別為白念珠菌，茄病鐮刀菌，尖端賽多孢菌，馬爾尼菲青霉，疣狀瓶霉，棒曲霉，日本曲霉以及雅致小克銀漢霉均未不能為RLB方法鑒定。

2.5 RLB敏感性檢測(cè)結(jié)果

通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法，RLB可以檢測(cè)的最低基因組DNA濃度為1.8×10-3ng/μL(見圖3)。

3 討 論

早期診斷并開展針對(duì)性的治療可以降低真菌感染的病死率，是提高治愈率的關(guān)鍵。但是，對(duì)于曲霉和毛霉目真菌感染，傳統(tǒng)的病原體診斷方法存在耗時(shí)久、敏感性和特異性低的缺陷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床早期特異診斷的需要。如直接鏡檢法可見到菌絲，但曲霉和毛霉目真菌形態(tài)相似，陰性結(jié)果亦不能排除診斷。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法可以確定真菌的種類，但耗時(shí)長，陽性率較低。病理學(xué)檢查在組織中查到真菌是疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是組織病理學(xué)檢查常常無特異性，不能將真菌鑒定到種的水平。而免疫組化及原位雜交技術(shù)目前也僅限于少數(shù)種類真菌的診斷及鑒定，這就限制了該兩項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用。因此，建立一種快速、敏感且可以同時(shí)鑒定多種臨床常見曲霉和毛霉目真菌的方法十分必要。

分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于病原真菌的分型、鑒定和親緣關(guān)系研究，為早日解決真菌感染的早期、特異診斷這一難題提供了良機(jī)［12］。PCR相關(guān)技術(shù)因具有敏感性高，特異性好，快速、便捷的優(yōu)勢(shì)，是目前最常用的分子生物學(xué)診斷手段，這些技術(shù)包括利用 PCR［13］、巢氏 PCR［14］、多重PCR［15］、Real time PCR［16］、限制性片段長度多態(tài)性分析［17］、RAPD［18］、ITS 區(qū)直接測(cè)序［19］、芯片技術(shù)等［20］。但是，鑒于致病真菌的物種多樣性，這些技術(shù)都有其自身局限性，例如，1次1種引物PCR擴(kuò)增不可能檢測(cè)多種真菌感染，多重PCR擴(kuò)增由于常見菌種的擴(kuò)增片段大小較為接近，單純通過凝膠電泳常常無法鑒定;限制性片段長度多態(tài)性分析，1種酶切有時(shí)無法鑒別多種菌種，多種酶切，片段類型復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力;探針雜交技術(shù)相對(duì)簡單可行，但是目前在念珠菌感染方面研究較多，鑒定真菌種類較少，且每次只能鑒定一種真菌，這些方法都無法滿足臨床快速一次高通量診斷的需要，無法同時(shí)檢測(cè)多種臨床常見的重要的真菌;而序列分析和芯片技術(shù)由于耗時(shí)較長、費(fèi)用較高，均未廣泛應(yīng)用于臨床診斷［12-20］。

文獻(xiàn)證實(shí)RLB技術(shù)可以檢測(cè)和鑒定臨床重要致病菌，包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌［7-11］。與其他分子生物學(xué)方法相比，RLB方法具有很多優(yōu)點(diǎn):易于操作，不需要使用凝膠電泳，具有費(fèi)用低和省時(shí)的優(yōu)點(diǎn);RLB方法使用序列種特異性探針來鑒定PCR產(chǎn)物，增加了檢測(cè)的敏感性(通過雜交以及顯色的信號(hào)放大)和特異性;只需1次PCR和1張膜即可以同時(shí)鑒定43株菌株，并且可以在1個(gè)工作日內(nèi)完成;標(biāo)記的膜可以重復(fù)使用50次以上均無明顯的信號(hào)丟失;MiniBlotter儀可以標(biāo)記45道探針，所以還可以同時(shí)檢測(cè)以上所有臨床常見的致病真菌，并可加入其他靶基因，例如其他新發(fā)現(xiàn)的重要真菌種類，并且可以根據(jù)研究需要進(jìn)行任意組合。尤其值得強(qiáng)調(diào)的是，RLB技術(shù)可以為真菌培養(yǎng)呈陰性結(jié)果及真菌混合感染的病例提供診斷。此外，RLB技術(shù)在早期診斷方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)于真菌培養(yǎng)需時(shí)長、病理診斷難以確定真菌的種類，RLB僅需1個(gè)工作日，包括DNA的提取 (大約3 h)、PCR(大約2 h)及用RLB技術(shù)檢測(cè)PCR產(chǎn)物(大約3 h)。而對(duì)于臨床樣本，我們通過用擴(kuò)增較小片段的引物 (ITS1和ITS2、ITS3和ITS4)來縮短PCR循環(huán)時(shí)間，可以臨床早期診斷真菌感染。

圖1 12種真菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果:1～12.12種菌的PCR結(jié)果 (分別為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、凍土毛霉菌、總狀毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、傘狀犁頭霉);M.100 bp ladder marker 圖2 反向線點(diǎn)雜交結(jié)果:1～12.12種菌的RLB結(jié)果 (分別為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、凍土毛霉菌、總狀毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、傘狀犁頭霉)。12種探針標(biāo)記的順序與表2所列一致，每種探針標(biāo)記2道代表不同的探針濃度 (0.2 pmol/L和0.4 pmol/L)。12種真菌的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的種特異性探針雜交，未與其余探針結(jié)合 圖3 RLB敏感性檢測(cè)結(jié)果:通過煙曲霉基因組DNA濃度10倍倍比稀釋法，PCR/RLB 可以檢測(cè)的最低基因組 DNA 濃度為1.8 ×10-3ng/μL(1.陰性對(duì)照，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3 ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)Fig.1 Results of PCR assay for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera;M.100 bp ladder marker) Fig.2 Results of PCR-based reverse line blot hybridization assay(PCR/RLB)hybridization for 12 strains(Lanes 1 to 12 represent the 12 strains in the following order:A.fumigatus，A.flavus，A.niger，A.terreus，A.nidulans，M.heimalis，M.racemosus，M.cercinelloidea，R.arrhizus，R.microsporus，R.pusillus，A.corymbifera).The 12 labeled probes are in the same order as in Tab.2 Duplicate rows for the same probe represent different concentrations(0.2 pmol/L and 0.4 pmol/L).PCR products for the 12 strains were hybridized with the species-specific probes，but not any other probes Fig.3Analytical sensitivity of PCR/RLB assay.The analytical sensitivity of PCR/RLB assay was 1.8 ×10-3ng/μL by 10-fold serial dilution of Aspergillus fumigatus genomic DNA(1.Negative control，2.1.8 ng/μL，3.1.8 ×10-1ng/μL，4.1.8 ×10-2ng/μL，5.1.8 ×10-3ng/μL，6.1.8 ×10-4ng/μL，7.1.8 ×10-5ng/μL，8.1.8 ×10-6ng/μL)

Zeng和Playford等應(yīng)用RLB技術(shù)來檢測(cè)一些臨床常見的念珠菌、曲霉菌和隱球菌［7-8］。但是遺憾的是他們的研究沒有涵括毛霉目真菌，而毛霉目真菌的感染發(fā)病率增加，特別在重癥糖尿病和器官移植患者發(fā)生的急進(jìn)性感染死亡率高，具有重要的臨床意義［3-4］。但是曲霉屬和毛霉目真菌，二者形態(tài)學(xué)近似，特別是當(dāng)病理學(xué)檢查，真菌成分?jǐn)?shù)量少、菌絲腫脹變形時(shí)，僅根據(jù)真菌的排列方式和真菌形狀難以鑒別二者。

據(jù)此，在本研究中，我們利用RLB技術(shù)檢測(cè)12種臨床重要的曲霉屬和毛霉目真菌，包括5種曲霉屬和7種毛霉目真菌。通過對(duì)98株臨床分離菌株提取真菌的DNA后用RLB技術(shù)鑒定，結(jié)果顯示與真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果、ITS區(qū)測(cè)序結(jié)果相一致，菌種之間沒有出現(xiàn)交叉雜交。本研究顯示RLB技術(shù)檢測(cè)與傳統(tǒng)真菌鑒定方法，DNA測(cè)序及病理學(xué)檢查比較，具有敏感性高 (1.8×10-3ng/μL)，特異性較高(100%)的特點(diǎn)，可以作為流行病學(xué)調(diào)查的工具及進(jìn)一步應(yīng)用于臨床標(biāo)本的快速診斷，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

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