曾榮 李岷 陳青 王樂 呂桂霞 沈永年 蔡晴 李彩霞 唐榮才 劉維達(dá)

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京 210042;2.江蘇省血液中心，南京 210042)

近年來(lái)，各種因素造成深部真菌感染發(fā)病率逐年上升。據(jù)報(bào)道在美國(guó)超過(guò)72%的院內(nèi)真菌感染為念珠菌所致，且在引起院內(nèi)血液播散感染的病原體中念珠菌排第4位［1］。新型抗真菌藥物棘白菌素類藥物 (Echinocandins)作為真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)β-(1→3)-葡聚糖合成酶抑制劑，它能夠通過(guò)破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而殺傷真菌細(xì)胞。念珠菌在此類藥物長(zhǎng)時(shí)間作用下能否出現(xiàn)耐藥情況尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在初步探索和評(píng)價(jià)卡泊芬凈(caspofungin，CAS)、米卡芬凈 (micafungin，MICA)長(zhǎng)時(shí)間作用念珠菌時(shí)的抗菌作用情況，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究尚少見報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

85株念珠菌均來(lái)自于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)醫(yī)學(xué)真菌中心，其中白念珠菌20株 (23.5%)，光滑念珠菌25株 (29.4%)，近平滑念珠菌12 株 (14.1%)，熱帶念珠菌8 株 (9.4%)，都柏林念珠菌6株 (7.1%)，乳酒念珠菌3株 (3.5%)，季也蒙念珠菌3株 (3.5%)，克柔念珠菌3株 (3.5%)，皺落念珠菌、維斯旺念珠菌、葡萄牙念珠菌、星形念珠菌、C.chiropterorum各1株 (1.2%)。以上包含2株藥物敏感質(zhì)控菌株，分別為克柔念珠菌ATCC6258和近平滑念珠菌ATCC22019。

1.2 藥物和培養(yǎng)基

卡泊芬凈 (Merck，本文縮寫為CAS)，米卡芬凈 (Fujisawa，縮寫為 MICA)，氟康唑 (Ffizer，縮寫為FLZ)，藥物均由藥廠惠贈(zèng)。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)867884)。

1.3 方法

參照CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，原NCCLS)推薦的微量液基稀釋法M27-A2 方案實(shí)施［2］。CAS、MICA 稀釋終濃度為0.03 ～32 μg/mL，F(xiàn)LZ 稀釋終濃度為 0.125 ～128 μg/mL，置于藥物敏感測(cè)試96孔板中，每孔100 μL。

真菌懸液的制備和接種 受試菌株先轉(zhuǎn)種至沙堡弱斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h?；罨?，取菌落于無(wú)菌生理鹽水中研磨，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL。用 RPMI 1640液體培養(yǎng)基將上述菌液稀釋1 000倍后加入藥物敏感測(cè)試板中，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)均檢測(cè)質(zhì)控株的MIC值范圍，若在質(zhì)控范圍內(nèi)，方可認(rèn)為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

終點(diǎn)判定 接種后的藥物敏感測(cè)試板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CAS、MICA組于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 和 168 h，F(xiàn)LZ 組于 48 h觀察結(jié)果，均采用倒置鏡下肉眼判讀MIC值。藥物敏感終點(diǎn)判讀參照M27-A2中微量液體培養(yǎng)基稀釋法的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)LZ MICs按照唑類藥物以80%抑制和100%抑制為觀察終點(diǎn);CAS、MICA MICs結(jié)果為便于與國(guó)內(nèi)外同行所得結(jié)果進(jìn)行比較，故以50%、90%抑制為觀察終點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0分析處理數(shù)據(jù)。MICs值采取取中位數(shù)的方法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 48 h卡泊芬凈、米卡芬凈、氟康唑體外對(duì)念珠菌的作用

CAS、MICA對(duì)85株念珠菌的作用結(jié)果見表1～2。48 h CAS對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌及其他念珠菌 MIC50、MIC90分別為 0.03 μg/mL、0.03 μg/mL，0.06 μg/mL、0.125 μg/mL，0.125 μg/mL、0.5 μg/mL。48 h MICA對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌及其他念珠菌 MIC50、MIC90分別為 0.03 μg/mL、0.03 μg/mL，0.06 μg/mL、0.06 μg/mL，0.25 μg/mL、0.5 μg/mL。48 h FLZ對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌及其他念珠菌 MIC80、MIC100分別為 2 μg/mL、128 μg/mL，64 μg/mL、128 μg/mL，2 μg/mL、32 μg/mL。

2.2 動(dòng)態(tài)觀測(cè)卡泊芬凈、米卡芬凈體外對(duì)念珠菌的作用

多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀測(cè)得出圖1～3所示現(xiàn)象?？ú捶覂艚M白念珠菌MIC50、MIC9024 h后不再升高。光滑念珠菌24 h和48 h MIC50均為0.06 μg/mL，而 72 h 升高至 0.125 μg/mL，之后不再升高;MIC90在24 h 和48 h 均為0.125 μg/mL，72 h 和96 h 均為0.25 μg/mL，至120 h 升高為0.5 μg/mL 后不再升高。其他念珠菌組24 h和48 h MIC50中位數(shù)均為 0.125 μg/mL，72 h 為 0.25 μg/mL，96 h、120 h、144 h 均為 0.5 μg/mL，168 h 升高為 1 μg/mL。MIC9024 h 為0.25 μg/mL，48 h、72 h 均為 0.5 μg/mL，96 h 為1 μg/mL，之后不再升高。米卡芬凈組白念珠菌、光滑念珠菌MIC50、MIC9024 h后不再升高。其他念珠菌組 MIC5024 h為0.125 μg/mL，48h為0.25μg/mL，72h為1μg/mL，之后不再升高。MIC90在24 h 為 0.125 μg/mL，48 h 為 0.5 μg/mL，72 h 為 1 μg/mL，之后不再升高。

表1 48 h CAS體外抗85株念珠菌MICs測(cè)定結(jié)果Tab.1 MICs of 85 isolates of Candida to CAS in vitro after 48 hours

表2 48 h MICA體外抗85株念珠菌MICs測(cè)定結(jié)果Tab.2 MICs of 85 isolates of Candida to MICA in vitro after 48 hours

2.3 耐藥情況分析

參考 CLSI M27-A2方案判定標(biāo)準(zhǔn)，氟康唑MIC80≤8 μg/mL 為敏感 (S)，MIC80介于 16 ～ 32 μg/mL之間為劑量依賴敏感 (S-DD)，MIC80≥64 μg/mL為耐藥 (R)。參考相關(guān)研究我們?cè)O(shè)定CAS、MICA MIC90≤2 μg/mL 為敏感 (S)，MIC90＞2 μg/mL 為耐藥 (R)［3］。

FLZ組有19株耐藥菌株，其中光滑念珠菌14株，白念珠菌3株，克柔念珠菌2株。CAS組共有5株耐藥菌株，分別為都柏林念珠菌2株，近平滑念珠菌、皺落念珠菌、維斯旺念珠菌各1株。12株近平滑念珠菌有7株MIC90≥1 μg/mL。MICA組有1株耐藥菌，為白念珠菌。12株近平滑念珠菌有9株MIC90≥1 μg/mL，明顯高于其他類型念珠菌。85株念珠菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)中對(duì)FLZ耐藥的菌株對(duì)CAS、MICA均較敏感。未見同時(shí)對(duì) CAS、MICA、FLZ耐藥的菌株。各菌株對(duì)CAS、MICA的敏感性較一致。

3 討 論

棘白菌素類抗真菌藥是一種新型抗真菌藥物，能夠特異性結(jié)合念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)β-(1→3)-葡聚糖合成酶，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致菌體破壞、死亡。由于其抗真菌作用較強(qiáng)、對(duì)人體的毒性低，故此類藥物如CAS、MICA已逐步應(yīng)用于臨床治療侵襲性念珠菌?。?-5］。

Macro等［6］利用CAS對(duì)400株念珠菌臨床分離株進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)得出MIC50、MIC90分別為0.06 μg/mL、0.25 μg/mL。本研究 48 h MICs 結(jié)果與其結(jié)果基本一致。Pfaller［3］利用 MICA對(duì)5 346株念珠菌進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)得出 MIC50、MIC90分別為 0.015 μg/mL、1 μg/mL。國(guó)內(nèi)喬建軍等［7］利用米卡芬凈對(duì)86株念珠菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)得出 MIC50、MIC90分別為 0.125 μg/mL、4 μg/mL。本研究48 h結(jié)果 MIC50、MIC90值分別為0.06 μg/mL、0.06 μg/mL，MIC50與上述結(jié)果相近，而 MIC90結(jié)果相對(duì)較低。Pfaller［3］等發(fā)現(xiàn) 99%以上念珠菌菌株在CAS、MICA藥物濃度≤2 μg/mL內(nèi)被抑制;而近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌在CAS作用時(shí)僅分別有92.5%、95.1%被抑制;而在MICA作用時(shí)分別有100%、100%被抑制。本研究中也發(fā)現(xiàn)了近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌比其他類型念珠菌MICs值高，耐藥情況多，結(jié)果與Pfaller基本一致。但是同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在待檢的6株都柏林念珠菌中有2株CAS MIC90＞2 μg/mL，耐藥比例達(dá)33%，這與Pfaller［3］的研究都柏林念珠菌對(duì)卡泊芬凈的敏感株＞99%不相符合。出現(xiàn)這種原因可能與本研究樣本量較少，念珠菌種類分布不同，結(jié)果判讀不同，或是存在地域差異有關(guān)。未出現(xiàn)同時(shí)對(duì)CAS、MICA、FLZ耐藥的菌株，對(duì)FLZ耐藥的念珠菌對(duì)CAS、MICA均較敏感，這與我們之前的研究一致［8］。

本研究根據(jù)微量液體稀釋法(M27-A2)方案，48 h為結(jié)果觀測(cè)點(diǎn)。為探索和評(píng)價(jià)卡泊芬凈、米卡芬凈長(zhǎng)時(shí)間作用念珠菌時(shí)的抗菌作用情況，故將觀察結(jié)果時(shí)間做了適當(dāng)延長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MICs有不同程度的升高，CAS組較MICA明顯，其他念珠菌組較白念珠菌、光滑念珠菌明顯。體外CAS、MICA作用于白念珠菌48 h后MIC50、MIC90無(wú)明顯變化。而其他念珠菌組在體外CAS處理后MICs 72 h后趨于穩(wěn)定，在體外MICA處理后MICs在96 h后趨于穩(wěn)定。Barry［9］等將卡泊芬凈體外作用于近平滑念珠菌和克柔念珠菌，分別于24 h和48 h觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)后一時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)的MICs較前者升高了一個(gè)濃度梯度。這與本研究的結(jié)果相一致。至于48 h后結(jié)果，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，其準(zhǔn)確性有待于更大樣本量的檢驗(yàn)。出現(xiàn)48 h后菌落繼續(xù)生長(zhǎng)的原因可能是菌落并未完全殺傷，殘存菌落繼續(xù)生長(zhǎng)所致。

本研究結(jié)果表明棘白菌素類藥物卡泊芬凈、米卡芬凈對(duì)念珠菌有均有較好的抗菌作用，其中對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌作用更強(qiáng)。動(dòng)態(tài)觀察所得藥敏結(jié)果可為棘白菌素類藥物的體外藥敏實(shí)驗(yàn)提供參考，也有可能有利于治療方案的改進(jìn)。今后的研究中，還將收集更多種類、數(shù)量及不同來(lái)源的臨床菌株進(jìn)行深入研究。

［1］Pfaller MA，Diekema DJ.Epidemiology of invasive candidiasis:a persistent public health problem［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(1):133-163.

［2］National committee for Clinical laborataory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts［S］.Approved standard M27-a.1997.

［3］Pfaller MA，Boyken L，Hollis RJ，et al.In vitrosusceptibility of invasive isolates ofCandidaspp.to anidulafungin，caspofungin，and micafungin:six years of global surveillance［J］.J Clin Microbiol，2008，46(9):3184-3185.

［4］Mora-Duarte J，Betts R，Rotstein C，et al.Comparison of caspofungin and amphotericin B for invasive candidiasis［J］.N Engl J Med，2002，347(25):2020-2029.

［5］Pappas PG，Rotstein CM，Betts RF，et al.Micafungin versus caspofungin for treatment of candidemia and other forms of invasive candidiasis［J］.Clin Infect Dis，2007，45(7):883-893.

［6］Marco F，Pfaller MA，Messer SA，et al.Activity of MK-0991(L-743，872)，a new echinocandin，compared with those of LY303366 and four other antifungal agents tested against blood stream isolates ofCandidaspp.［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，1998，32(1):33-37.

［7］喬建軍，劉偉，萬(wàn)喆，等.米卡芬凈對(duì)分離自中國(guó)的念珠菌和曲霉臨床株體外抑菌活性的研究［J］.中國(guó)真菌學(xué)雜志，2007，2(1):5-9.

［8］李岷，沈永年，呂桂霞，等.棘白菌素對(duì)氟康唑耐藥的念珠菌體外藥物敏感性的研究［J］.中國(guó)真菌學(xué)雜志，2009，4(2):78-81.

［9］Barry AL，Pfaller MA，Brown SD，et al.Quality control limits for broth icrodilution susceptibility tests of ten antifungal agents［J］.J Clin Microbiol，2000，38(9):3457-3459.