徐 霞， 賴 寬， 郭 慶， 曾凡欽△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院皮膚科，廣東廣州510120;2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院皮膚科，廣東廣州510515)

系統(tǒng)性硬皮病是一種以皮膚及內(nèi)臟器官纖維化或硬化、最后發(fā)生萎縮為特點的疾病。系統(tǒng)性硬皮病目前尚無特效治療方法，患者常死于肺纖維化、肺部感染、腎功能衰竭等。系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病機制尚不明確［1］。已有研究報道系統(tǒng)性硬皮病皮膚損害及內(nèi)臟組織中有白細胞介素17(interleukin－17，IL－17)浸潤［2］，但 IL－17在系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病中具體作用仍不是很清楚。本研究檢測了重組人白細胞介素17A(recombinant human interleukin－17A，rhIL－17A)對體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞生物學(xué)特性的作用，旨在探討IL－17在系統(tǒng)性硬皮病皮膚損害發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 材料

角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液(K－SFM)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及0.02%EDTA－0.25%胰蛋白酶購自Gibco;DispaseⅡ購自Sigma;鼠抗人廣譜角蛋白單克隆抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠IgG(H+L)、小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、ABC顯色試劑盒和生物素化馬抗小鼠Ⅱ抗購自博士德公司;CCK－8購自日本同仁化學(xué)研究所;rhIL－17A購自R＆D;兔抗人NF－κB/p65單克隆抗體、兔抗人 IκBα單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購自Cell Signaling;IL－6和TGF－β1的ELISA試劑盒購自華美生物公司。

2 方法

2.1 人角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)及鑒定

①人角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng) 取環(huán)切術(shù)后包皮，將所取標(biāo)本用含1×105U/L氨芐青霉素和100 mg/L鏈霉素的PBS浸泡15 min。PBS漂洗3次后，用眼科剪去除多余的皮下組織，將皮膚剪成8 mm×3 mm×4 mm小塊，再用PBS洗3次，移入1.6×103U/L dispaseⅡ，4℃消化過夜后剝離表皮。將分離的表皮置于0.02%EDTA－0.25%胰蛋白酶中，37℃消化10 min;用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化;反復(fù)吹打后過篩，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，K－SFM重懸，調(diào)整濃度為1×108cells/L，接種6孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，3～4 d換液1次。

②人角質(zhì)形成細胞的鑒定 胰酶消化第2代細胞接種于48孔板，于指數(shù)生長期進行免疫熒光檢測。4%多聚甲醛固定細胞后，1%Triton處理5 min。3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)37℃封閉30 min，加鼠抗人角蛋白Ⅰ抗，4℃過夜，PBS洗3次，加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠IgG(H+L)Ⅱ抗孵育1 h，DAPI染核5 min，熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)。隨機取5個互不重疊的高倍視野(×200)，分別于綠色和藍色熒光下，計算(胞漿)免疫熒光陽性細胞數(shù)和總的細胞數(shù)(細胞核數(shù))，并根據(jù)結(jié)果計算陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，進行純度評價。

2.2 人成纖維細胞的培養(yǎng)及鑒定

①人成纖維細胞的培養(yǎng) 取環(huán)切術(shù)后包皮，將所取標(biāo)本用含1×105U/L氨芐青霉素和100 mg/L鏈霉素的PBS浸泡15 min。PBS漂洗3次后，剪去脂肪及表皮組織，將組織修剪成1 mm×2 mm×2 mm大小組織塊均勻涂布瓶底，緩慢加入少量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，第2 d向瓶內(nèi)再加少許培養(yǎng)液。

②人成纖維細胞的鑒定 胰酶消化第3代細胞接種于48孔板，以小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體為Ⅰ抗，生物素化馬抗小鼠為Ⅱ抗，用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結(jié)(SP)法進行細胞免疫組化染色，同時設(shè)置用PBS作為Ⅰ抗的陰性對照。細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞。

2.3 CCK－8檢測 將培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞以1 500 cells/well的密度接種至96孔板，24 h后用不含表皮生長因子的K－SFM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)6 h，處理組加入 rhIL－17A(濃度為 50、100、200、400 μg/L)，并設(shè)不加rhIL－17A的對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，每孔加入 CCK－8溶液10 μL，37℃孵育30 min，選擇450 nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值。

將培養(yǎng)的人成纖維細胞以1 500 cells/well的密度接種至 96孔板培養(yǎng) 24 h，用含 0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)6 h，處理組加入含rhIL－17A(濃度為 50、100、200、400 μg/L)的 5%FBS－DMEM培養(yǎng)液，并設(shè)不加rhIL－17A的對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，每孔加入CCK－8溶液10 μL，37 ℃孵育30 min，選擇 450 nm 波長，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值。

2.4 Western blotting檢測成纖維細胞NF－κB/p65和IκBα表達量 待常規(guī)培養(yǎng)在12孔板中的成纖維細胞生長至60%融合時，隨機分成4組，0 μg/L、4 μg/L、40 μg/L 和 400 μg/L 的 rhIL－17A 處理組，培養(yǎng)96 h后進行Western blotting檢測。用細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白樣品煮沸變性后，SDS－PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜放入含有脫脂奶粉的容器中封閉1 h，加入稀釋的Ⅰ抗，室溫下脫色搖床上4℃振蕩過夜。T－BST洗滌后加入Ⅱ抗，室溫孵育0.5 h，T－BST漂洗，加入顯色底物，曝光X線片，顯影，定影，通過ImageJ圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將濃度為1×108cells/L的人角質(zhì)形成細胞和濃度為2×108cells/L成纖維細胞分別接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸盡上清，加入 400 μg/L rhIL－17A，并設(shè)不加rhIL－17A的陰性對照。作用4 d后，收集細胞，在PBS中吹勻為單細胞懸液，按Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒的說明處理細胞，進行 Annexin V－PI標(biāo)記，上流式細胞儀檢測細胞是否存在凋亡及所占比例。

2.6 ELISA法檢測成纖維細胞 IL－6和TGF－β1的分泌量 將成纖維細胞以6×104cells/well的密度接種24孔板，24 h后處理組加rhIL－17A(5、50、500 μg/L)，同時設(shè)置不加 rhIL－17A的對照組，培養(yǎng)4d后收集細胞培養(yǎng)上清，使用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中IL－6和TGF－β1含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

每組實驗重復(fù)3次，應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 角質(zhì)形成細胞的原代培養(yǎng)、鑒定及純度計算

原代培養(yǎng)24 h可見圓形、類橢圓形的細胞貼壁，并呈小集落向周圍生長，培養(yǎng)初期出現(xiàn)的少量成纖維細胞逐漸被優(yōu)勢生長的角質(zhì)形成細胞取代。達80%融合時進行傳代培養(yǎng)，傳代后細胞生長加快。細胞免疫熒光染色胞漿顯示亮綠色熒光，見圖1A，角質(zhì)形成細胞純度為(96.00+1.28)%。

Figure 1.Identification of keratinocytes(A)and fibroblasts(B)(×200).A:keratin detected by immunofluorescence;B:vimentin detected by immunohistochemisty.圖1 角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的鑒定

2 rhIL－17A對體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞活性及凋亡的影響

0、50 、200 、400 μg/L rhIL－17A 處理角質(zhì)形成細胞后，450 nm波長下檢測的吸光度值分別為1.068±0.350、1.025 ±0.175、1.112 ± 0.128、1.047 ±0.209和1.105±0.115，各組之間無顯著差異(P＞0.05)。400 μg/L rhIL－17A處理組細胞凋亡率為(8.50±0.48)%，與對照組細胞［(7.86±0.60)%］相比無顯著差異(P＞0.05)。rhIL－17A對體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的活性與凋亡無明顯影響。

3 成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

約第5 d可見培養(yǎng)的組織塊周圍有棱形、不規(guī)則三角形細胞萌出，細胞質(zhì)向外伸出2－3個長短不同的突起，待細胞融合后，細胞排列緊密，呈放射狀、編織狀。約9 d細胞長滿瓶底，去掉組織塊消化細胞進行傳代培養(yǎng)。細胞免疫組化染色，胞漿呈棕色染色，見圖1B;對照組用PBS代替Ⅰ抗，細胞質(zhì)未著色。

4 rhIL－17A對體外培養(yǎng)人成纖維細胞活性及凋亡的影響

為了檢測rhIL－17A能否誘導(dǎo)成纖維細胞增殖，使用rhIL－17A刺激正常人成纖維細胞，CCK－8檢測發(fā)現(xiàn)rhIL－17A可以刺激成纖維細胞的增殖，其對成纖維細胞的這種刺激作用隨著其濃度的增大而增強。400 μg/L培養(yǎng)4 d后，成纖維細胞活性增至陰性對照的2.3倍，見圖2。400 μg/L rhIL－17A處理組細胞凋亡率為(4.29±0.34)%，對照組細胞凋亡率為(3.51±0.43)%，無顯著差異(P＞0.05)。

5 rhIL－17A對體外培養(yǎng)人成纖維細胞NF－κB/p65和IκBα表達的影響

rhIL－17A作用于成纖維細胞96 h后，NF－κB/p65表達明顯高于對照組(0 μg/L)，而 IκBα 蛋白的表達較對照組明顯減少，呈劑量依賴性，見圖3。

Figure 2.Effect of rhIL－17A on the vialbility of fibroblasts detected by CCK－8/assay.*P ＜0.05 vs 0 μg/L rhIL－17A.圖2 rhIL－17A對成纖維細胞增殖的影響

6 rhIL－17A對體外培養(yǎng)人成纖維細胞分泌IL－6和TGF－β1的影響

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)rhIL－17A作用成纖維細胞后，隨著rhIL－17A濃度的增高，IL－6和TGF－β1的分泌量均逐漸增加，見圖4。2組與對照組比差別顯著(P ＜0.05)。

Figure 3.Effect of rhIL－17A on the expression of NF－κB/p65 and IκBα proteins.±s.n=3.*P＜0.05 vs 0 μg/L rhIL－17A.圖3 rhIL－17A對成纖維細胞NF－κB/p65和IκBα表達的影響

討 論

盡管系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病機制仍不十分清楚，但是免疫學(xué)異常在其中起著重要作用已成共識。成纖維細胞持續(xù)活化及隨之發(fā)生的膠原合成增加是病情進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。目前，硬皮病中成纖維細胞激活的機制仍不十分清楚。系統(tǒng)性硬皮病患者外周血中Th17細胞比例增高，此外皮膚損害及肺組織中檢測到IL－17，均提示IL－17可能在系統(tǒng)性硬皮病的發(fā)病中起著重要作用［2］。IL－17A是由一種新型Th細胞亞群——Th17細胞分泌的主要細胞因子，可誘導(dǎo)細胞因子IL－6、IL－8、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G－CSF)、粒巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte and macrophage colony stimulating factor，GM－CSF)、基質(zhì)細胞源性因子1(stromal cell－derived factor 1，SDF－1)和金屬蛋白酶的產(chǎn)生引起前炎癥反應(yīng)。大量的研究表明IL－17在許多自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。IL－17受體普遍表達于角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等細胞表面［4，5］。

Figure 4.Secretion of interleukin－6 and TGF－β1by fibroblasts with the stimulation of rhIL－17A.was tested by ELISA.±s.n=3.*P＜0.05 vs 0 μg/L rhIL－17A.圖4 rhIL－17A刺激成纖維細胞分泌IL－6和TGF－β1

本實驗結(jié)果顯示，rhIL－17A對體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的增殖沒有明顯影響，與Nograles等［6］使用rhIL－17體外作用于全皮膚模型的研究結(jié)果相一致。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)rhIL－17A處理組和對照組角質(zhì)形成細胞凋亡率未見明顯差異，說明rhIL－17A對角質(zhì)形成細胞的凋亡亦不存在明顯影響。以上研究提示促炎癥因子IL－17A對表皮的主要組成細胞角質(zhì)形成細胞的增殖與凋亡無明顯影響。

NF－κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，典型的NF－κB由p53和p65亞基組成。在靜息狀態(tài)，NF－κB與抑制性蛋白IκBα結(jié)合以無活性的潛在狀態(tài)存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細胞受到炎癥細胞因子、病毒感染、內(nèi)毒素等刺激時，IκBα磷酸化后NF－κB得以釋放發(fā)生核移位，進入核內(nèi)與特異性免疫球蛋白輕鏈基因增強子cB序列特異性結(jié)合，促進輕鏈基因的表達，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和調(diào)控作用［7］。NF－κB參與調(diào)控多種細胞增殖、凋亡［8］。對肝纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB能促進各種細胞因子釋放，促進炎癥反應(yīng)，激活肝星狀細胞，是肝纖維化時的重要轉(zhuǎn)錄因子［9，10］。本實驗結(jié)果顯示rhIL－17A增強了成纖維細胞NF－κB/p65的表達，降低IκBα的表達，說明rhIL－17A可以激活成纖維細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，提示IL－17A對成纖維細胞活性增強的這種促進作用可能是通過激活NF－κB實現(xiàn)。

IL－17已被證實能增加成纖維細胞表面細胞間黏附分子－1(intercellular cell adhesion molecule－1，ICAM－1)的表達［11］。激活的內(nèi)皮細胞通過ICAM－1及激活白細胞、血小板導(dǎo)致微循環(huán)障礙，從而引起內(nèi)皮細胞損傷［12］。本實驗結(jié)果顯示，rhIL－17A可以促進體外成纖維細胞的增殖，并且這種刺激作用呈現(xiàn)劑量依賴性。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長狀態(tài)良好，rhIL－17A處理組細胞未見明顯凋亡，說明能引起前炎癥反應(yīng)的IL－17A不會促進成纖維細胞凋亡。此外，rhIL－17A作用于成纖維細胞可以促進成纖維細胞分泌IL－6和TGF－β1。Ogura等［13］亦研究發(fā)現(xiàn) IL－17A 可以激發(fā)小鼠成纖維細胞產(chǎn)生過量的IL－6，導(dǎo)致F759小鼠發(fā)生自身免疫性關(guān)節(jié)炎。IL－6是IL－17A參與自身免疫性疾病發(fā)病過程的關(guān)鍵下游信號分子。Duncan等［14］發(fā)現(xiàn)IL－6可以刺激成纖維細胞增殖和膠原合成。使用抗IL－6抗體可以抑制系統(tǒng)性硬皮病患者成纖維細胞前膠原的產(chǎn)生［15］。Oi等［16］發(fā)現(xiàn)硬皮病小鼠模型硬化的皮膚中TGF－β1表達增加。TGF－β1是已知的致纖維化細胞因子，可以誘導(dǎo)成纖維細胞合成細胞外基質(zhì)，此外TGF－β1還可以誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子的產(chǎn)生，從而促進皮膚、肺、腎等組織纖維化的發(fā)生［17］。以上研究結(jié)果提示IL－17促進成纖維細胞的增殖及促進IL－6和TGF－β1的分泌，可能是導(dǎo)致成纖維細胞持續(xù)活化及隨之發(fā)生膠原合成增加的原因之一，在硬皮病的發(fā)病中可能起著重要作用。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)rhIL－17A對表皮中的角質(zhì)形成細胞的活性無明顯影響，卻可以增強真皮中成纖維細胞的活性。IL－17A對成纖維細胞活性增強的這種促進作用，可能是通過激活NF－κB實現(xiàn)。IL－17A除了直接作用引起成纖維細胞活化，亦可能是通過誘導(dǎo)IL－6和TGF－β1的產(chǎn)生從而引起成纖維細胞增殖和膠原合成，對此尚有待使用抗體拮抗劑來阻斷相應(yīng)細胞因子的作用來進一步研究證實。此外，該研究結(jié)果是從正常細胞的研究中得出的，rhIL－17A對硬皮病中這2種細胞的影響還有待進一步研究。

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