劉 燕,傅躍先,邱 林,田曉菲,甘立強,肖 軍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院燒傷整形科 400014)

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是創(chuàng)傷愈合的異常結(jié)局,可造成機體的外形改變和功能障礙,并伴有癢痛,影響生活質(zhì)量,迄今為止,HS的治療方法多種多樣,但療效有限。近年來中藥抑制病理性瘢痕生長并促進其軟化逐漸被人們發(fā)現(xiàn),并用于研究。故本課題設(shè)計兔活體HS模型作為實驗對象,通過紅花注射治療后了解其對HS及其 TGFβ1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 27只新西蘭大白兔,雌雄不限,體質(zhì)量(1 885.875±82.191 9)g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。500 g/L紅花注射液由山西太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。鼠抗TGFβ1多克隆抗體購于美國Santa Cruz biotechnology公司。鼠/兔s-p試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒等購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。PCR引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。Taq酶、DNsaeI(RNase free)、M-Mulv Reverse Transcriptase購自上海生物工程有限公司。RNA提取試劑 Tripure reagent為Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HS模型的建立 于兔耳腹側(cè)手術(shù)切除1 cm×1 cm大小皮膚及軟骨膜,間距為 3 cm,每耳 2塊,無菌紗布包扎[1]。

1.2.2 分組及給藥 術(shù)后第45天開始對兔耳HS進行治療,其中右耳外側(cè)HS為陽性對照組,不予以任何處理;右耳內(nèi)側(cè)HS為生理鹽水組,注射生理鹽水;左耳內(nèi)側(cè)HS為低濃度紅花組,注射125 g/L紅花注射液;左耳外側(cè)HS為高濃度紅花組,注射500 g/L紅花注射液。注射量均為0.15 mL,待HS發(fā)白時停止注射。每周1次,共注射4次。自身兔耳腹側(cè)皮膚作對照。

表1 HS厚度及硬度(±s)

表1 HS厚度及硬度(±s)

a:P＜0.05,與陽性對照、生理鹽水組、低濃度紅花組比較;b:P＜0.05,與各HS組比較。

組別厚度(mm)術(shù)后第45天(n=24)注射后2周(n=8)注射后4周(n=8)注射后6周(n=8)硬度(N/mm2)術(shù)后第45天(n=24)注射后2周(n=8)注射后4周(n=8)注射后6周(n=8)陽性對照組 0.3070±0.04350.2661±0.01960.2220±0.00640.1733±0.0111 0.6858±0.02190.6574±0.01400.6428±0.00570.6059±0.0064生理鹽水組 0.3117±0.01560.2715±0.01620.2145±0.00440.1714±0.0106 0.6896±0.01760.6566±0.00880.6359±0.01080.6053±0.0077低濃度紅花組 0.3093±0.01710.2443±0.01890.2063±0.00220.1695±0.0083 0.6813±0.01930.6554±0.01550.6320±0.01420.6030±0.0087高濃度紅花組 0.3060±0.02080.2455±0.01530.1815±0.0130a0.1310±0.0128a 0.6847±0.01890.6526±0.01320.6056±0.0121a0.5278±0.0172a正常皮膚組 0.0609±0.0089b0.0608±0.0100b0.0596±0.0096b0.0629±0.0087b 0.4316±0.0059b0.4321±0.0084b0.4345±0.0049b0.4311±0.0030b

1.2.3 表觀檢查 術(shù)后第 45天,注射完成后第 2、4、6周,分別用SEQUIA512彩色多普勒彩色超聲診斷儀13HZ高頻探頭檢測瘢痕及皮膚厚度,硬度計測量瘢痕及皮膚硬度。

1.2.4 標(biāo)本采集 注射完成后(以后表述為注射后)第 2、4、6周分別切取8只兔耳HS標(biāo)本,同時,于右耳腹側(cè)各切取1塊相同大小的皮膚標(biāo)本。標(biāo)本的各一半分別于多聚甲醛液和液氮保存。

1.2.5 TGFβ1蛋白表達的檢測 采用免疫組織化學(xué)法,多聚甲醛固定后的標(biāo)本經(jīng)包埋、切片、烘烤、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、封閉血清、加鼠抗 TGFβ1多克隆抗體、加二抗、蛋白結(jié)合、顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片后,光學(xué)顯微鏡下觀察10個視野,并采用IPP軟件進行TGFβ1蛋白面密度(視野中被分析物體的總面積/視場面積)處理[2]。

1.2.6 TGFβ1mRNA表達的測定 采用RT-PCR,即總RNA提取,并除去RNA中的DNA污染;cDNA第一鏈合成,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,反應(yīng)體積20 μL,反應(yīng)條件為42℃,孵育 60min,99℃5min終止反應(yīng),4℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶;TGFβ1引物合成上游引物 F5′-CTT CTCCACCAACTACTGCTTC-3′下游引物 R5′-CTCCAC CTTGGGCTTGCGGC-3′(288bp);PCR擴增,PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性13min,然后按94℃30s、55℃30s、72℃30s進行32個循環(huán),最后72℃延伸 8min;根據(jù)擴增片段,進行1.1%瓊脂糖電泳,最后用Band-scan掃描系統(tǒng),測定各產(chǎn)物密度值,用凝膠自動成像儀拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SAS8.2軟件分析,統(tǒng)計學(xué)采用完全隨機設(shè)計下的多組之間的多重比較方法(SNK方法)對HS厚度、硬度、TGFβ1蛋白面密度及 TGFβ1mRNA 平均光密度值進行分析,數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HS表觀改變 術(shù)后第45天,兔耳HS發(fā)生率為89.81%(術(shù)后第4、5天,2個創(chuàng)面發(fā)生穿孔;術(shù)后第 45天,9個創(chuàng)面未形成HS;未形成HS的創(chuàng)面及發(fā)生穿孔創(chuàng)面位于3只兔耳中),呈暗紅色,高出體表皮膚,質(zhì)硬,HE染色見真皮層內(nèi)大量成纖維細胞增殖,并且有與人類HS相似的結(jié)節(jié)或旋渦狀結(jié)構(gòu)。注射后2、4、6周,各組 HS色澤均逐漸變淺,厚度逐漸變低,硬度逐漸變小,尤以高濃度紅花組明顯,高濃度紅花組在注射后4、6周兩值均較其他各HS組低(P＜0.05),見表1。

2.2 各組 TGFβ1蛋白表達檢測結(jié)果 注射后第 2、4、6周,各HS組 TGFβ1蛋白面密度呈下降趨勢,同一時間段高濃度紅花組均為各HS組中最低值(P＜0.05),見表2。

表2 各組 TGFβ1面密度測定結(jié)果比較( ±s,n=8)

表2 各組 TGFβ1面密度測定結(jié)果比較( ±s,n=8)

a:P＜0.05,與陽性對照、生理鹽水組比較;b:P＜0.05,與其他各HS組比較;c:P＜0.05,與各HS組比較。

組別 注射后2周 注射后4周 注射后6周陽性對照組 0.2058±0.0027 0.1903±0.0029 0.1152±0.0018生理鹽水組 0.2104±0.0036 0.1914±0.0023 0.1061±0.0024低濃度紅花組 0.2023±0.0010 0.1807±0.0014a 0.1062±0.0023高濃度紅花組 0.1826±0.0023b0.1347±0.0015b0.0757±0.0021b正常皮膚組 0.0310±0.0020c 0.0384±0.0061c0.0348±0.0043c

2.3 TGFβ1mRNA表達測定結(jié)果 RT-PCR法通過電泳條帶的平均光密度值反映TGFβ1mRNA的表達,二者成反比關(guān)系。陽性對照、生理鹽水組TGFβ1mRNA平均光密度值在注射后第2、4、6周無明顯變化且接近;高、低濃度紅花組 TGFβ1mRNA平均光密度值在注射后第2、4、6周均逐漸升高,且尤以高濃度紅花組明顯;三時間段高濃度紅花組TGFβ1mRNA平均光密度值均較其他各HS組高(P＜0.05);低濃度紅花組TGFβ1mRNA平均光密度值在注射后第4及6周均較陽性對照及生理鹽水組高(P＜0.05),見表3。

表3 各組 TGFβ1mRNA平均光密度測定結(jié)果比較( ±s,n=8)

表3 各組 TGFβ1mRNA平均光密度測定結(jié)果比較( ±s,n=8)

a:P＜0.05,與陽性對照、生理鹽水組比較;b:P＜0.05,與其他各HS組比較;c:P＜0.05,與各HS組比較。

組別 注射后2周 注射后4周 注射后6周陽性對照組 0.7605±0.0181 0.7510±0.0078 0.7445±0.0089生理鹽水組 0.7402±0.0066 0.7328±0.0111 0.7425±0.0094低濃度紅花組 0.7618±0.0108 0.9207±0.0106a1.1011±0.0049a高濃度紅花組 1.5738±0.0109b1.6675±0.0081b1.8165±0.0119b正常皮膚組 1.9451±0.0122c 1.9285±0.0149c1.9441±0.0117c

3 討 論

HS形成是多種細胞及細胞因子相互作用、調(diào)控的結(jié)果[3],轉(zhuǎn)化生長因子(TGFa)在其中扮演著重要角色。TGFβ1被認(rèn)為是促纖維化發(fā)展的最重要的生長因子,它既可促進成纖維細胞增殖并分泌基質(zhì)成分,又可抑制其降解。在創(chuàng)傷修復(fù)過程中,TGFβ1是巨噬細胞、中性粒細胞的有力激活劑,經(jīng)自分泌和旁分泌,TGFβ1局部濃度增加,激活巨噬細胞,提高TGFβ1mRNA的表達,進一步促進成纖維細胞增殖。甚至加入外源性的TGFβ1也可增加創(chuàng)傷中膠原纖維、蛋白和炎性細胞的數(shù)量,TGFβ1被認(rèn)為是促進瘢痕組織形成必需的因素[4]。

近年研究還發(fā)現(xiàn)瘢痕形成與細胞外基質(zhì)代謝異常[5]、高自由基[6]、過度脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、過度炎性反應(yīng)及免疫有關(guān)[7-8]。

中醫(yī)認(rèn)為瘢痕系氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者相輔而成所致,因此活血化淤、軟堅散結(jié)成為中醫(yī)治療瘢痕的關(guān)鍵。紅花為活血化淤類中藥的重要代表藥物,近年研究發(fā)現(xiàn)紅花具有減少自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、炎性反應(yīng)等作用[9-10]。已有研究證明紅花能抑制腎小管間質(zhì)纖維化、肝臟纖維增生[11],丹參紅花提取物能抑制心肌間質(zhì)成纖維細胞膠原合成[12]、抑制體外培養(yǎng)的人HS成纖維細胞的增殖和膠原合成[13]。本文結(jié)果顯示,高濃度紅花能促進HS厚度及硬度降低,低濃度和高濃度的紅花藥液均能抑制TGFβ1的表達,且高濃度紅花明顯優(yōu)于低濃度紅花,兩種濃度紅花藥液對兔耳HS模型的表觀改變基本一致。故推測紅花抑制兔耳增生性瘢痕的機制可能與TGFβ1的表達被抑制相關(guān)。

紅花注射液為中藥提取物,其成分復(fù)雜,藥理表明紅花黃色素是紅花中的主要有效成分[14-15]。研究表明紅花黃色素可抑制脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、控制炎癥過程病理變化的肉芽增生[16-17],故推測紅花黃色素可能為抑制HS的有效成分。在今后的研究中,有待進一步明確紅花作用的具體有效成分及其作用機制。

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