黃占文,張 偉,陳 躍

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,四川瀘州646000)

腫瘤靶向成像是近年來分子影像學(xué)研究的熱點之一[1-2]。分子影像學(xué)就是致力于采用非侵襲性手段來鑒別正常細胞與非正常細胞在早期病理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變之前的特征性生物標(biāo)志物的變化。對于隱匿性生物標(biāo)志物的檢測,在腫瘤當(dāng)中,只要求高靈敏度的探測器使用低分辨率的掃描技術(shù),但要定量判斷和定性這些腫瘤組織的病理學(xué)特征必須要高清晰度的成像。核醫(yī)學(xué)顯像可以高度靈敏的檢測這些微量生物標(biāo)志物,但是這些技術(shù)與磁共振成像相比,分辨率就遜色得多[3]。而多學(xué)科交融的雙模式、多模式影像探針提供了一個全新的研究角度,國外已有相關(guān)報道[4-8],而國內(nèi)對此類多模式影像探針研究尚少。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),锝(99Tcm)標(biāo)記二乙三胺五乙酸-脫氧葡萄糖(DTPA-DG)能夠參與多種腫瘤細胞增殖,反映細胞核活性,并可用于早期探測腫瘤病灶及化療效果評價[9-11];釓離子(Gd3+)具有很強的順磁作用,在磁共振對比劑中應(yīng)用最多,若能把Gd3+同DTPA-DG結(jié)合并進行99Tcm標(biāo)記,將會是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ碾p模式影像探針。本研究擬在二乙三胺五乙酸-脫氧葡萄糖釓鹽(Gd-DTPA-DG)的基礎(chǔ)上,對其進行99Tcm標(biāo)記,確定最佳標(biāo)記反應(yīng)條件,觀察其在裸鼠體內(nèi)的生物分布情況,并探討其作為一種雙模式影像探針的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)3周齡雄性 BalB/c裸鼠24只,體質(zhì)量(18±3)g,SPF三級,由四川大學(xué)實驗動物中心提供;(2)實驗材料為氯化亞錫(SnCl2?2H2O,成都科龍化工試劑廠生產(chǎn))、胰蛋白酶(北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、DMEM培養(yǎng)基(GIB-CO/BRL公司生產(chǎn))、小牛血清(鄭州佰安生物工程有限公司生產(chǎn))、胰酶和青霉素鏈霉素雙抗(GIBCO/BRL公司生產(chǎn))、新華1號層析紙:杭州新華紙業(yè)公司生產(chǎn))、99Mo-99Tcm發(fā)生器(北京原子高科股份有限公司生產(chǎn))、人宮頸癌Hela細胞株(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供)等;(3)主要實驗儀器為Mini-Scan TLC Scanner薄層放射性掃描儀(美國BIOSCAN公司生產(chǎn))、CRC-15R活度計(美國 Capintec公司生產(chǎn))、AB204-S電子分析天平(瑞士梅特勒公司生產(chǎn))、DL-6M大容量低速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn))、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海醫(yī)療器械七廠生產(chǎn))、TC23233二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SHELLAB生產(chǎn))、超凈操作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn))等。

1.2 方法

1.2.199Tcm-Gd-DTPA-DG的標(biāo)記 (1)反應(yīng)介質(zhì)p H值對放化純度和標(biāo)記率的影響:取8個潔凈的西林瓶,每瓶中依次加入10 mg Gd-DTPA-DG、0.6 mg SnCl2?2H2O,然后分別用0.1 mmol/L HCl及0.1 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)各反應(yīng)液的p H值為 1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,控制溶液體積為 2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脫液(37 MBq),沸水反應(yīng)30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,測定其放化純度和標(biāo)記率;(2)還原劑SnCl2?2H2O的用量對放化純度和標(biāo)記率的影響:取6個潔凈的西林瓶,每瓶加入10 mg Gd-DTPA-DG,然后分別加入 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg 的 SnCl2?2H2O,用 0.1 mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0,控制溶液為2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脫液(37 MBq),沸水反應(yīng)30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,測定其放化純度和標(biāo)記率;(3)反應(yīng)溫度對放化純度和標(biāo)記率的影響:取8個潔凈的西林瓶,每瓶中加入10 mg的Gd-DTPA-DG,然后分別加入0.6 mg SnCl2?2H2O、0.1 mmol/L HCl調(diào)節(jié)p H值為2.0,控制溶液為2 mL,再加入0.2 mL Na99TcmO4洗脫液(37 MBq),分別于 30、40、50、60、70、80、90、100 ℃反應(yīng)30 min即得99Tcm-Gd-DTPA-DG,放化純度和標(biāo)記率。

1.2.299Tcm-Gd-DTPA-DG標(biāo)記率的測定 采用薄層紙層析法(TLC),新華1號(1 cm×20 cm)層析紙為支持物,距離下緣1 cm處用毛細管點樣,自然晾干后分別以生理鹽水和丙酮為展開劑,在層析缸中上行展開10 cm后,終止,晾干,按照操作說明書在薄層放射性掃描儀上測定標(biāo)記率。

1.2.399Tcm-Gd-DTPA-DG的體外穩(wěn)定性 將新制備的99Tcm-Gd-DTPA-DG置于室溫下,不同時間取樣分析,測定99Tcm-Gd-DTPA-DG在室溫下的存放穩(wěn)定性,以便為臨床用藥提供指導(dǎo),由于99Tcm的半衰期為6 h,故只測定反應(yīng)后6 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.4 小鼠體內(nèi)分布 取昆明小鼠30只,隨機分成6組,每組5只。經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL約1.85 MBq99Tcm-Gd-DTPA-DG 后,于 10、30 min及1、2、4、24 h斷頭處死小鼠。取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、骨、血液,稱重后用γ計數(shù)儀測定放射性計數(shù),并計算每克臟器的放射性計數(shù)占注入劑量的百分數(shù)(%ID/g)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)記反應(yīng)的條件優(yōu)化 當(dāng)Gd-DTPA-DG用量為10 mg時,保持SnCl2?2H2O用量及其他因素不變,放化純度和標(biāo)記率在溫度為70℃以上時逐漸增高,達85%以上;至90℃時反應(yīng)達高峰,在90～100℃時反應(yīng)變化不大,最高可達98.5%(圖1)。隨著SnCl2?2H2O用量的增加,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化純度和標(biāo)記率迅速增加。SnCl2?2H2O用量在0.4～0.6 mg時,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化純度和標(biāo)記率略有上升,當(dāng)SnCl2?2H2O用量達到0.6mg時,99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化純度和標(biāo)記率已達到98%以上(圖 2)。當(dāng)SnCl2?2H2O用量超過0.7 mg或低于0.3 mg時,99Tcm-Gd-DTPADG的放化純和標(biāo)記率開始下降。本實驗中,采用的SnCl2?2H2O用量為0.6 mg。反應(yīng)體系在太酸和中性及堿性溶液中放化純及標(biāo)記率不高,尤其在pH＞7時,已降到42%以下,pH＜5～＞1.5時,反應(yīng)體系放化純度及標(biāo)記率逐漸增加,在p H為1.5～2.0時達最高值(95.5%),見圖3。

圖1 不同反應(yīng)溫度對99 Tcm-Gd-DTPA-DG標(biāo)記率的影響

圖2 不同SnCl2? 2H 2 O用量對99 Tcm-Gd-DTPA-DG標(biāo)記率的影響

圖3 不同pH值對99 Tcm-Gd-DTPA-DG標(biāo)記率的影響

2.299Tcm-Gd-DTPA-DG放化純度及穩(wěn)定性 在丙酮展開體系中,99Tcm-Gd-DTPA-DG和水解還原99TcmO2的Rf為0～0.1,游離99TcmO4的 Rf為 0.9～1.0;在生理鹽水展開體系中,99Tcm-Gd-DTPA-DG 和游離99TcmO4的 Rf為0.9～1.0,水解還原99TcmO2的 Rf為0～0.1。據(jù)此計算得99Tcm-Gd-DTPA-DG的放化純度大于98%。標(biāo)記物在室溫放置6 h,放化純度大于96%。

2.399Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布 注射99Tcm-Gd-DTPA-DG從10 min到2 h內(nèi)均顯示出較高的腫瘤攝取,分別達(6.53±1.45)、(3.51±0.86)、(2.58±0.56)、(1.48±0.12)%ID/g(表1)。腎臟中的放射性較高,而肝臟、脾臟及小腸中放射性攝取不高,這可能是由于99Tcm-Gd-DTPA-DG是非膠體顯像劑,其主要排泄途徑是經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外。腦組織中放射性分布最低,最高僅為(0.36±0.07)%ID/g,其他各臟器的放射性攝取值隨著時間的推移逐漸減小,在給藥24 h后幾乎已經(jīng)接近本底;而腫瘤中的放射性攝取值從30 min至4 h均明顯高于血液、肺臟、肌肉、腦等組織,在注射2 h后,腫瘤與肌肉的放射性攝取比(T/NT)最高,達2.91,表明99Tcm-Gd-DTPA-DG的腫瘤靶向性較好。

表1 99 Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布(±s,%ID/g,n=5)

表1 99 Tcm-Gd-DTPA-DG在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布(±s,%ID/g,n=5)

組織 10 min 30 min 1 h 2 h 4 h 24 h血液 10.61±4.28 2.52±0.12 1.93±0.39 1.20±0.15 0.49±0.05 0.30±0.02心臟 2.72±0.22 0.63±0.06 0.67±0.02 0.94±0.03 0.21±0.02 0.16±0.01腦0.36±0.07 0.20±0.01 0.16±0.02 0.14±0.01 0.04±0.01 0.03±0.01肺臟 6.29±23.7 1.75±0.28 1.47±0.37 1.46±0.60 0.40±0.02 0.17±0.02腎臟 16.01±6.17 11.27±2.35 9.32±2.27 3.54±1.76 2.61±0.68 0.42±0.21脾臟 2.25±0.14 1.10±0.34 0.94±0.31 0.86±0.24 0.33±0.04 0.20±0.02肝臟 3.01±0.52 1.04±0.21 1.01±0.34 1.41±0.37 0.74±0.03 0.36±0.03肌肉 4.86±1.51 2.59±0.45 1.20±0.11 0.51±0.08 0.36±0.02 0.24±0.08小腸 1.96±0.19 0.96±0.04 0.97±0.08 0.67±0.05 0.34±0.05 0.12±0.12腫瘤 6.53±1.45 3.51±0.86 2.58±0.56 1.48±0.12 0.63±0.08 0.29±0.06

3 討 論

99Tcm標(biāo)記Gd-DTPA-DG簡便易得,標(biāo)記率高,穩(wěn)定性好。裸鼠體內(nèi)分布實驗表明其具有良好的腫瘤靶向性。SnCl2?2H2O還原標(biāo)記中,SnCl2?2H2O起著很重要的作用,SnCl2?2H2O過少,影響還原99TcmO4-的能力,使游離的高锝酸增加,放化純度和標(biāo)記率偏低;SnCl2?2H2O過多,則容易反應(yīng)生成膠體,導(dǎo)致放化純度和標(biāo)記率降低。其原因可能與SnCl2?2H 2 O在偏酸的體系中比較穩(wěn)定及配體Gd-DTPA-DG本身偏堿性有關(guān)。結(jié)果顯示,腎臟中的放射性較高,而肝臟、脾臟及小腸中放射性攝取不高,可能是由于99Tcm-Gd-DTPA-DG是非膠體顯像劑,其主要排泄途徑是經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外。這可能是由于Gd-DTPA-DG為水溶性分子,其相對分子質(zhì)量較FDG大,不易通過血腦屏障。作為一種脫氧葡萄糖類順磁性對比劑,Gd-DTPA-DG已在磁共振上顯示出一定的腫瘤強化價值[12],99Tcm標(biāo)記有望使其成為一種能同時應(yīng)用于MRI和單光子發(fā)射計算機斷層顯像(SPECT)檢查的雙模式影像探針,將進一步提高腫瘤的診斷效率。

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