齊希光，張 暉，王 立，郭曉娜，錢海峰

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

麥麩阿魏酰低聚糖抗氧化性的研究

齊希光，張 暉*，王 立，郭曉娜，錢海峰

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

研究了麥麩中阿魏酰低聚糖(FOs)的體外抗氧化作用。結(jié)果表明，F(xiàn)Os具有良好的體外抗氧化效果，并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。其對Fe2+具有一定的螯合作用，對H2O2的清除作用略低于同濃度的VC，而對·OH的清除作用卻高于同濃度的甘露醇，對DPPH·的清除能力與BHT有相同的變化趨勢，清除能力略低于同濃度的BHT，對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血具有明顯的抑制作用。

麥麩，阿魏酰低聚糖，抗氧化，自由基

近年來，有關(guān)谷物和以谷物為原料制品的抗氧化性質(zhì)的研究報(bào)道較少［1］。谷物中的酚酸類化合物，包括阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、芥子酸和綠原酸，主要存在于谷物籽粒的皮層中，谷物的抗氧化活性以及富含谷物麩皮的膳食對人體健康的益處主要?dú)w功于它們的存在，這點(diǎn)已被廣泛認(rèn)同［2］。許多研究表明，酚酸抗氧化劑在很多抗氧化分析體系中具有中和自由基的能力［3］。阿魏酰低聚糖(FOs)不僅含有阿魏?；疫€含有親水性的糖體部分，使其具有水溶性和熱穩(wěn)定性。到目前為止，有關(guān)麥麩不溶性膳食纖維中的水溶性FOs的抗氧化活性研究較少。本文通過分析FOs對Fe2+的螯合作用，對·OH、過氧化氫和DPPH·的清除作用，以及對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制作用等，對FOs的抗氧化能力進(jìn)行了綜合評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耐溫α－淀粉酶、水解蛋白酶和精制糖化酶 諾維信中國總部;B.subtilis木聚糖酶 武漢新華楊生物有限公司;麩皮 訂購，粉碎后，過0.5mm篩備用;SD大鼠 體重200～230g，江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所;維生素C、丁基化羥基甲苯(BHT)、甘露醇、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;1，1－二苯代－2－苦基?；?Sigma公司;其它化學(xué)試劑 均為分析純。

HITACHI 650－60熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FOs制備方法 參見文獻(xiàn)［4］。

1.2.2 FOs對Fe2+的螯合作用 以EDTA作為參考物質(zhì)［5］，具體方法為:將 0.25m L 1.0mmol/L FeSO4溶液與等體積不同濃度(0～5.0mg/m L)的測試樣品溶液混合，分別在混合物中加入0.5m L Tris－HCl緩沖液(pH7.4)、0.5m L 1.0mg/m L 2，2'－聯(lián)吡啶溶液(聯(lián)吡啶溶解在0.2mol/L HCl中)、0.4m L 100.0mg/m L鹽酸羥胺和2.5m L乙醇，終體積定容到5m L，搖勻，在室溫下反應(yīng)10m in，在522nm下測定混合物的吸收度。

1.2.3 FOs對 H2O2的清除作用 用0.1mmol/L，pH7.4的磷酸緩沖液在20℃下制備2.0mmol/L H2O2溶液，取3.4m L不同濃度(0～0.6mg/m L)的樣品液(樣品溶解在0.1mmol/L，pH7.4磷酸緩沖液中)與600μL H2O2溶液混合，反應(yīng)10m in，在230nm下測定混合物中H2O2的濃度。以磷酸緩沖液作空白，維生素 C 作為參考物質(zhì)［6］。

1.2.4 FOs對·OH的清除作用 將500μL不同濃度的樣品(0～1.4mg/m L)與100μL 2.8mmol/L脫氧核糖、200μL 100mol/L FeCl3(與 104mol/L EDTA 預(yù)混合液，v/v為 1∶1)、100μL 1.0mmol/L 過氧化氫和100μL 100mol/L維生素C混合，在37℃溫孵60m in，加入1m L 5g/L TBA溶液(溶解在100g/L三氯乙酸中)，混勻后，在沸水浴中加熱15min，然后迅速用冰浴冷卻，終止反應(yīng)，反應(yīng)液離心5m in(12000r/min)，在532nm處測定上清液的吸光度，以磷酸緩沖液作空白，以甘露醇作為參考物質(zhì)［7］。

1.2.5 FOs對DPPH·的清除作用 以BHT作為參考物質(zhì)，具體方法為:將0.2m L不同濃度(0～10.0mg/mL)的樣品溶液與0.8m L Tris－HCl緩沖液(100mmol/L，pH7.4)和1.0m L 0.5mmol/L DPPH甲醇溶液混合，搖勻后，室溫避光反應(yīng)30m in，在517nm下測定混合物的吸光度［8］。

1.2.6 FOs對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制作用

大鼠用20%烏拉坦麻醉，眼眶取血，肝素抗凝，4℃3000 r/m in離心10m in去除血漿，紅細(xì)胞用 pH7.4 PBS洗滌3次，制成1%的紅細(xì)胞懸液［9］。取紅細(xì)胞懸液1m L，加入不同濃度的 FOs(0～6.0mg/m L)，加H2O2(終濃度100mmol/L)混勻，37℃水浴1h，用生理鹽水稀釋5倍，1000 r/m in離心10m in，取上清液于415nm比色測定，以不加FOs管為100%溶血，計(jì)算溶血度及抑制率，正常組為空白組不經(jīng)任何處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 FOs對Fe2+的螯合作用去質(zhì)子酚酸化合物的苯氧基具有很高的電荷密度，能夠結(jié)合一些帶電的過渡金屬離子，所以富含酚酸化合物的植物提取物能夠螯合和穩(wěn)定某些過渡金屬離子，螯合金屬離子的能力是抗氧化劑的重要性質(zhì)之一。2，2'－聯(lián)吡啶能夠定量地與Fe2+形成紅色螯合物，在有其它螯合劑存在的情況下，這個紅色螯合物的形成將會被破壞，顏色也隨之減退。因此，可以通過測定顏色的減少量來評價一些共存螯合劑的螯合作用。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)Os干擾Fe2+與2，2'－聯(lián)吡啶形成紅色螯合物，結(jié)果如圖1所示?？梢?，F(xiàn)Os能夠比

2，2'－聯(lián)吡啶搶先捕獲Fe2+，而顯示出對Fe2+的螯合作用。FOs對Fe2+的螯合作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系，隨

FOs濃度增加，其對Fe2+的螯合作用增強(qiáng)，當(dāng)FOs濃度達(dá)到4.0mg/m L時，接近平衡，此時對Fe2+的螯合能力可以達(dá)到同濃度EDTA的67.4%。

2.2 FOs對H2 O2的清除作用

過氧化氫(H2O2)屬于活性氧系列，它可由超氧歧化酶(SOD)歧化超氧陰離子(·)而來，而其中又以吞噬細(xì)胞的吞噬過程及線粒體的電子傳遞鏈為產(chǎn)生H2O2的主要途徑。由于H2O2不具有未成對電子，因此不屬于自由基，是氧被還原成水的過程中最穩(wěn)定的中間物質(zhì)，雖然H2O2不會立刻與生物分子作用，但其對生物體的傷害卻比其他種類自由基要大，因?yàn)镠2O2通?？裳趸恍┟副匦杌鶊F(tuán)上的巰基而導(dǎo)致酶失活;過氧化氫還可以快速跨過紅細(xì)胞膜，一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可能與胞內(nèi)的Fe2+和Cu2+進(jìn)行反應(yīng)，對生物體造成更嚴(yán)重的氧化傷害［9］。

圖1 不同濃度FOs和DETA對Fe2+的螯合作用

圖2給出了FOs對H2O2的清除能力，表明二者之間存在濃度依賴關(guān)系，當(dāng)FOs濃度達(dá)到0.5mg/m L，對H2O2的清除作用可以達(dá)到同濃度維生素C的80%。由于FOs上的阿魏?；且粋€良好的電子供體，它們可能加速H2O2轉(zhuǎn)變成水，而顯示出對H2O2明顯的清除作用。

圖2 FOs和維生素C對H2 O2的清除能力

2.3 FOs對·OH的清除作用

羥基自由基(·OH)是氧自由基的一種。在所有的自由基中，羥基自由基的毒性最大，對人體的危害最重，它極易與生物體分子反應(yīng)，不但通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)直接損害細(xì)胞膜，而且可以使許多人體重要的酶活性降低或消失。更重要的是羥自由基能夠直接損傷細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，影響細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

采用Fe3+、維生素C和H2O2混合物在EDTA存在的條件下，反應(yīng)產(chǎn)生·OH后［7］，抗氧化劑將在一定程度上與脫氧核糖競爭和·OH的反應(yīng)，從而降低脫氧核糖的降解速率。而·OH進(jìn)攻脫氧化核糖所降解的產(chǎn)物進(jìn)一步生成MDA，后者再與硫代巴比妥酸(TBA)結(jié)合生成紅色的發(fā)色團(tuán)，抗氧化劑清除能力越大，被降解的脫氧核糖越少，溶液的顏色也就越淺。由此也可以說明，抗氧化劑抑制脫氧核糖降解的相對程度反映了對羥基自由基的清除能力或?qū)e2+的螯合能力。結(jié)果如圖3所示。

在EDTA存在的情況下，甘露醇是一種羥基自由基的特異性清除劑［10］，抑制脫氧核糖降解具有劑量效應(yīng)關(guān)系，其EC50值為1.03mg/m L。與甘露醇相比，F(xiàn)Os對羥基自由基具有更明顯的清除作用，其清除率與FOs存在劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著FOs濃度的增加，對·OH的清除作用增強(qiáng)，其EC50值為0.46mg/m L。FOs的EC50值只有甘露醇EC50值的44.7%。上述結(jié)果表明，F(xiàn)Os對Fe2+的螯合作用可能牽涉到對脫氧核糖降解的抑制，也說明了FOs能夠保護(hù)食品、保健品等中的糖類物質(zhì)免受·OH誘導(dǎo)的氧化損害。FOs明顯的羥基自由基清除能力使得它將有可能成為一種極具潛力的天然抗氧化劑。

圖3 FOs和甘露醇清除·OH的能力

2.4 FOs對DPPH·的清除作用

相對穩(wěn)定的有機(jī)自由基DPPH·已被廣泛用于測定單個化合物和植物提取物的抗氧化活性。植物化學(xué)物質(zhì)通常對以氮為中心的自由基DPPH·具有很強(qiáng)的清除作用［11］。

FOs和BHT清除DPPH·的能力如圖4所示。從圖4中可以看出，F(xiàn)Os對DPPH·具有強(qiáng)烈的清除作用。當(dāng)FOs的濃度在0～1.0mg/m L時，清除能力隨濃度上升而增加明顯;濃度高于1.0mg/m L時，清除能力趨緩，在80%左右。FOs的EC50值(0.52mg/m L)比BHT的 EC50值(0.09mg/m L)大。盡管 FOs清除DPPH·的能力低于BHT，但FOs濃度為10.0mg/m L時，其清除能力達(dá)到84.5%，可與合成抗氧化劑BHT相媲美。

圖4 FOs和BHT清除DPPH·的能力

酚酸抗氧化劑(ArOH)可以通過兩種不同的機(jī)制與自由基DPPH·(X·)進(jìn)行反應(yīng)，一是自由基直接從酚酸上抽取氫原子;二是酚酸或酚氧陰離子(ArO·)將電子轉(zhuǎn)移給自由基DPPH·，通常在極性溶劑里，抽氫反應(yīng)是主要的［12］。阿魏酰低聚糖在0～1.0mg/m L濃度范圍內(nèi)，清除自由基DPPH·具有劑量效應(yīng)關(guān)系，這可能要?dú)w功于FOs中阿魏?；姆恿u基，其上的氫原子很容易被自由基DPPH·抽取。

2.5 FOs對H2 O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制作用

紅細(xì)胞具有典型的生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，被廣泛地應(yīng)用于膜脂質(zhì)過氧化研究。生物體內(nèi)紅細(xì)胞處于充足的氧環(huán)境中，含有啟動和催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的金屬絡(luò)合物血紅蛋白，且膜上富含多價不飽和脂肪酸，這些特點(diǎn)均使得紅細(xì)胞對氧化損傷極為敏感。因而考察抗氧化劑對紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響被公認(rèn)為是研究細(xì)胞氧化損傷的重要方法之一。H2O2可對紅細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化、膜蛋白交聯(lián)、血紅蛋白氧化及細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)濃度降低等。在氧化損傷嚴(yán)重的情況下，細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜的破壞可引起細(xì)胞的死亡和破裂［13］。

從表1可以看出，加入H2O2可使紅細(xì)胞膜氧化損傷，胞內(nèi)容物外流，溶血量顯著高于正常組。而加入不同濃度FOs后，均可抑制溶血現(xiàn)象發(fā)生，溶血抑制率隨著FOs濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為6.0mg/m L時，對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞的溶血抑制率接近于0.1mg/m L的VC。

表1 FOs對H2 O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的影響

3 結(jié)論

FOs具有良好的體外抗氧化效果。當(dāng)FOs濃度為4.0mg/m L時，其對Fe2+的螯合能力達(dá)到同濃度EDTA的67.4%;濃度為0.5mg/m L時，對 H2O2的清除作用達(dá)到同濃度維生素C的80%;FOs的EC50值只有甘露醇EC50值的44.7%;FOs濃度為10.0mg/m L時，其對DPPH·的清除能力達(dá)到84.5%，可與合成抗氧化劑BHT相媲美;濃度為6.0mg/m L時，對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞的溶血抑制率接近于0.1mg/m L的VC。

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Study on antioxidative activity of feruloyl oligosaccharides

QIXi－guang，ZHANG Hui*，WANG Li，GUO Xiao－na，QIAN Hai－feng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology＆School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Antioxidative activity of feruloyl olig osaccharides(FOs)was investigated.The results showed that FOs had excellent antioxidative activity and revealed dose－effect relationship.It could chelate Fe2+to some extent.Its scavenging activity for hydrogen peroxide was slightly inferior to VC，but was better than mannitol for·OH.Its scavenging capability for DPPH·was similar to that for BHT.The effect on red blood cell hemolysis induced by H2O2could be markedly inhibited by FOs.

feruloyl;olig osaccharides;antioxidation;free radical

TS201.1

A

1002－0306(2011)08－0071－04

2010－07－19 *通訊聯(lián)系人

齊希光(1968－)，男，在職碩士，研究方向:食品功能因子。

國家863項(xiàng)目(2006AA10Z333);國家十一五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B06)。