揭 偉， 申志華， 王曉燕， 況 東， 王國(guó)平， 敖啟林△

(1廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理教研室，廣東 湛江 524023；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所，湖北 武漢 430030)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

大鼠心肌素慢病毒RNA干擾載體的構(gòu)建及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞分化的影響*

揭 偉1, 2， 申志華1， 王曉燕2， 況 東2， 王國(guó)平2， 敖啟林2△

(1廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理教研室，廣東 湛江 524023；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所，湖北 武漢 430030)

目的構(gòu)建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干擾(RNAi)重組質(zhì)粒，分析該RNAi質(zhì)粒的干擾效果及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)分化的影響。方法設(shè)計(jì)并合成3對(duì)針對(duì)大鼠myocardin的shRNA片段，退火后將雙鏈oligo-DNA克隆入慢病毒質(zhì)粒載體pGCSIL- GFP獲得重組干擾質(zhì)粒pGCSIL- GFP - shMyocd。以pEGFP - N1 / X124G表達(dá)載體構(gòu)建含F(xiàn)lag標(biāo)簽的myocardin表達(dá)質(zhì)粒pEGFP - N1- Myocd。將重組干擾質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blotting分析Flag標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，篩選出干擾效率最好的干擾質(zhì)粒并大量擴(kuò)增。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈VSMCs，RT - PCR和Western blotting檢測(cè)myocardin及分化標(biāo)志物SM22α的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建大鼠myocardin的慢病毒干擾質(zhì)粒pGCSIL- GFP - shMyocd和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP - N1 - Myocd。上述2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，1號(hào)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Flag標(biāo)簽蛋白表達(dá)下降最顯著。將1號(hào)質(zhì)粒進(jìn)行大包裝，獲得滴度為1×1012TU/L的慢病毒顆粒，該病毒轉(zhuǎn)染VSMCs后，myocardin表達(dá)明顯下調(diào)并伴隨分化標(biāo)志物SM22α表達(dá)的顯著下降。結(jié)論成功構(gòu)建大鼠myocardin慢病毒重組干擾質(zhì)粒pGCSIL- GFP - shMyocd；抑制基因myocardin表達(dá)后伴隨VSMCs分化的表達(dá)下降，提示myocardin在VSMCs分化過(guò)程中的重要性。pGCSIL- GFP - shMyocd重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建為后續(xù)研究特定病理?xiàng)l件下(如動(dòng)脈粥樣硬化)VSMCs表型轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

心肌素; 載體構(gòu)建; 慢病毒; 血管平滑肌細(xì)胞; 細(xì)胞分化

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是維持血管張力和功能的主要細(xì)胞成分，在血管壁病理過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。在特定環(huán)境下，VSMCs可以發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停铣尚蚔SMCs的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)并能分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)、血管損傷后狹窄等病灶的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。迄今為止VSMCs表型轉(zhuǎn)變的機(jī)制仍未得到有效闡明[1]。在VSMCs的分化發(fā)育過(guò)程中，一系列標(biāo)志物順序表達(dá)。大部分VSMCs標(biāo)志基因在其啟動(dòng)子增強(qiáng)區(qū)域都包含1個(gè)至多個(gè)特異性CArG [CC(A/T)6GG] 序列，這些基因都由一種較廣泛表達(dá)的順式結(jié)合因子即血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)及其輔助激活因子心肌素即myocardin來(lái)調(diào)控[2]。

Myocardin是Wang[3]等用生物信息學(xué)方法從心臟特異性表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)的SRF的輔助因子。它不與DNA直接結(jié)合，而是通過(guò)與SRF結(jié)合形成三元復(fù)合物來(lái)調(diào)控依賴于CArG的基因轉(zhuǎn)錄[4]。Myocardin在干/祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞分化的分子開(kāi)關(guān)成分之一[5]。前期我們發(fā)現(xiàn)高糖和低氧刺激誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)變的VSMCs中myocardin表達(dá)下降，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚[6, 7]。因而基于myocardin分子來(lái)探討VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有顯著的理論及潛在的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)基于慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pGCSIL - GFP構(gòu)建了針對(duì)大鼠myocardin重組干擾載體，轉(zhuǎn)染VSMCs后觀察myocardin及分化標(biāo)志物SM22α的表達(dá)改變，初步分析myocardin在VSMCs分化過(guò)程中作用，為進(jìn)一步深入探討myocardin在VSMCs表型轉(zhuǎn)變中的作用的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 質(zhì)粒pGCSIL- GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0，大腸桿菌菌株 DH5α和293T細(xì)胞由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司提供；pEGFP - N1 / X124G質(zhì)粒和DNA ladder由上海捷瑞公司提供；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen；AgeI、EcoR I、KpnI、T4 DNA連接酶及buffer購(gòu)自NEB；BCA試劑盒購(gòu)自HyClone - Pierce；ECL-Plu sKit購(gòu)自Amersham；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和DMSO購(gòu)自Gibco；Lipofectamine 2000和Opti - MEM購(gòu)自Invitrogen；羊抗鼠myocardin、兔抗鼠IgG - HRP和兔抗羊IgG - HRP購(gòu)自Santa Cruz；鼠抗Flag購(gòu)自Sigma；小鼠抗β-actin購(gòu)自碧云天。

2方法

2.1Myocardin慢病毒干擾質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)大鼠myocardin mRNA(NM_182667)序列信息，結(jié)合設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和設(shè)計(jì)軟件 (http://hydra1.wistar.upenn.Edu/Projects/siRNA/siRNAindex.htm )進(jìn)行評(píng)估測(cè)定，經(jīng) BLAST表明不與大鼠其它 cDNA序列同源，合成3對(duì)干擾DNA序列和1對(duì)陰性對(duì)照(NC)序列(表1)，其兩端含酶切位點(diǎn)黏端。1號(hào)重組質(zhì)粒靶序列：GAT GCA TTT GCC TTT GAA GAT;2號(hào)重組質(zhì)粒靶序列：GAC ACA ATC CAG GAT CTC ACT;3號(hào)重組質(zhì)粒靶序列：CAG AAA GTG ACA AGA ACG ATA;重組陰性對(duì)照(NC)質(zhì)粒靶序列(scrambled sequence)：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T。將表1中的寡核苷酸各5 μL，緩沖液20 μL 和70 μL雙蒸水混合，90 ℃ 4 min，70 ℃10 min，冷卻至室溫后經(jīng)12 %非變性PAGE凝膠檢測(cè)雙鏈形成效率，T4噬菌體DNA連接酶將雙鏈DNA 連接入經(jīng)AgeI和EcoR I雙酶切線性化的慢病毒pGCSIL- GFP載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR和測(cè)序(ABI 3730，Invitrogen)鑒定。PCR上游引物5’- CCT ATT TCC CAT GAT TCC TTC ATA - 3’，下游引物5’- GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG - 3’。陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，最后質(zhì)粒DNA測(cè)定濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 病毒載體干擾序列

2.2Myocardin-GFP融合蛋白過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 大鼠myocardin mRNA CDS位于244-3 060 nt處，整個(gè)CDS區(qū)域序列較長(zhǎng)，因此獲得整個(gè)CDS區(qū)域表達(dá)質(zhì)粒較困難。我們選擇性人工合成一段從244-1 023 nt的RNA序列，該合成序列包含上述3對(duì)干擾序列作用靶點(diǎn)。將合成序列克隆入經(jīng)EcoR II、KpnI雙酶切的pEGFP-N1 / X124G質(zhì)粒從而構(gòu)建pEGFP - N1 - Myocd過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)蛋白質(zhì)與GFP形成融合蛋白。將pEGFP - N1 - Myocd過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白GFP的表達(dá)情況，判斷pEGFP - N1 - Myocd過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功與否。

2.3有效myocardin干擾靶點(diǎn)質(zhì)粒篩選 生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞按1×108cells/L 接種于24孔板，80 % - 90 %融合時(shí)換成400 μL Opti- MEM。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，每孔表達(dá)載體的量均為0.5 μg，干擾質(zhì)粒量分為0.25 μg和0.5 μg，Lipofectamine 2000體積均為1 μL。將質(zhì)粒和Lipofectamine 2000分別溶解于Opti- MEM中，混勻，室溫靜置5 min，將稀釋好的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置20 min，把質(zhì)粒DNA與Lipofectamine 2000的混合液加入293T細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，換成新鮮的含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察預(yù)估轉(zhuǎn)染率，48 h后收集細(xì)胞，抽提總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

2.4Myocardin干擾載體慢病毒擴(kuò)增及滴度測(cè)定 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T 細(xì)胞以含10 %胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 6×108cells/L，接種于15 cm培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24 h后達(dá) 70 % - 80 %融合可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h換為無(wú)血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGCSIL - Myocd 載體 20 μg，pHelper 1.0 載體 15 μg，pHelper 2.0 載體10 μg)，與相應(yīng)體積的 Opti- MEM 混合均勻，總體積為 2.5 mL，在室溫下溫育5 min。取 100 μL Lipofectamine 2000 試劑在另一管中與 2.4 mL Opti- MEM 混合，室溫下溫育 5 min。稀釋后的 DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000 進(jìn)行混合，室溫下溫育 20 min，以便形成 DNA與Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，常規(guī)培養(yǎng)8 h后棄去培養(yǎng)基，加入20 mL PBS洗滌。加入含10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)基 25 mL，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 48 h，收集上清，于 4℃ 4 000 ×g離心10 min除去細(xì)胞碎片，0.45μm濾器過(guò)濾上清。把病毒粗提液加入到過(guò)濾杯中，蓋上蓋子，將過(guò)濾杯插到濾過(guò)液收集管中，在 4 000 ×g離心10 min - 15 min到需要的病毒濃縮體積，病毒分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕?支病毒用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度。換算公式為：滴度 (103TU/L ) = 觀察到帶有熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)/病毒原液量。

2.5大鼠主動(dòng)脈VSMCs慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及效果分析 雄性SD大鼠(250 g)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。組織貼塊法分離主動(dòng)脈VSMCs并用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色鑒定，實(shí)驗(yàn)用第3代。VSMCs接種24孔板后約70%融合時(shí)，按MOI = 120加入pGCSIL- GFP - shMyocd，每孔培養(yǎng)基總體積250 μL(含4 mg/L polybrene 1μL)，轉(zhuǎn)染8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后收獲細(xì)胞，提取蛋白和RNA，分別用RT - PCR和Western blotting 檢測(cè)myocardin和SM22α的表達(dá)。

2.6mRNA表達(dá)分析 Trizol試劑抽提總RNA，2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用半定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)。Myocardin上游引物5’- GGG TCT GAA CAC TCT TTG C - 3’, 下游引物5’- ATT ACC GTG GAG GCT TGG A - 3’，產(chǎn)物大小254 bp；SM22α上游引物5’- AGC CAG TGA AGG TGC CTG AGA AC - 3’，下游引物5’- TGC CCA AAG CCA TTA GAG TCC TC - 3’，產(chǎn)物大小181 bp；β- actin上游引物5’- CAT TGT TGC CCA TCA ACG ACC - 3’，下游引物5’- TCA CAC CCA TCA CAA ACA TG - 3’，產(chǎn)物大小173 bp。PCR退火溫度53 ℃。引物均由Invitrogen公司合成。產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照(Gel Doc1 000, Bio - Rad)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Western blotting 冰上裂解細(xì)胞15 min后將樣品轉(zhuǎn)移入EP管中，超聲破碎儀破碎細(xì)胞(200 W共4次，每次5 s，間隔2 s)，4 ℃ 12 000×g離心15 min，經(jīng)BCA法測(cè)蛋白濃度后調(diào)整樣品蛋白終濃度為2 g/L。蛋白經(jīng)12 % SDS - PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5 %脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉PVDF膜1 h，Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min，Ⅱ抗室溫下孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL試劑顯色后拍照。應(yīng)用抗體為：小鼠抗Flag(F1804，1∶5 000)，小鼠抗β-actin(AA128，1∶ 5 000)，羊抗鼠IgG - HRP(sc-2005，1∶8 000)，羊抗鼠myocardin(sc-21561，1∶500)，兔抗羊IgG- HRP (sc-2030，1∶8 000)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1成功構(gòu)建慢病毒干擾質(zhì)粒

將合成的3對(duì)針對(duì)myocardin不同靶點(diǎn)序列和1對(duì)陰性對(duì)照雙鏈oligo-DNA連接入經(jīng)AgeI和EcoR I雙酶切pGCSIL - GFP線性化慢病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)氨芐西林抗性基因篩選，挑選出陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR(圖1)和測(cè)序驗(yàn)證(未發(fā)表資料)無(wú)誤，證實(shí)合成的oligo-DNA正確連接入線性化pGCSIL- GFP載體；連接入shRNA片段的陽(yáng)性克隆PCR片段大小為343 bp，沒(méi)有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為306 bp。電泳鑒定其大小在預(yù)期范圍，證實(shí)成功構(gòu)建了慢病毒干擾質(zhì)粒，標(biāo)記為pGCSIL- GFP - shMyocd和pGCSIL - GFP - NC。

Figure 1. Electrophoresis of positive clones of recombinant pGCSIL-GFP vector. lane 1: ddH2O；lane 2: pGCSIL - GFP；lane 3: marker (5.0 kb, 3.0 kb, 2.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp)；lane 4-8: positive clones.

2成功構(gòu)建myocardin-Flag-GFP融合蛋白過(guò)表達(dá)質(zhì)粒

pEGFP - N1 / X124G質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和KpnI酶切后去除X124G過(guò)渡序列，接入myocardin(244 nt - 1 023 nt)和Flag表達(dá)序列后構(gòu)建pEGFP - N1 - Myocd真核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)myocardin - Flag - GFP融合蛋白。該過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，證實(shí)過(guò)表達(dá)載體正常工作,見(jiàn)圖2。

Figure 2. Construction and transfection of myocardin-overexpression vector.A: sequencing result of partial myocardin CDS (244 nt - 284 nt);B: green fluorescent was observed in 293T cells transfected with myocardin-overexpression vectors.

3有效干擾靶點(diǎn)慢病毒鑒定及擴(kuò)增

將不同靶點(diǎn)pGCSIL - GFP - shMyocd載體和pEGFP - N1 - Myocd過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)來(lái)判斷轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞經(jīng)提取蛋白，Western blotting檢測(cè)Flag的表達(dá)來(lái)判斷干擾載體的敲減效應(yīng)，結(jié)果證實(shí)設(shè)計(jì)的3個(gè)靶點(diǎn)中2個(gè)具有明顯基因表達(dá)敲減效應(yīng),見(jiàn)圖3。我們選擇性包裝了1號(hào)質(zhì)粒(#1)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(NC)，其滴度分別達(dá)到1×1012TU/L和5×1012TU/L。

4慢病毒干擾質(zhì)粒降低VSMCs中myocardin和收縮基因表達(dá)

將包裝的1號(hào)慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMCs后，RT - PCR和Western blotting結(jié)果均顯示pGCSIL - GFP - shMyocd質(zhì)粒顯著降低VSMCs中myocardin表達(dá)，同時(shí)伴隨VSMCs收縮標(biāo)志物SM22α mRNA和蛋白表達(dá)水平的顯著下降,見(jiàn)圖4。

討 論

慢病毒RNA干擾系統(tǒng)是1型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)為基礎(chǔ)改造的病毒基因載體質(zhì)粒，載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈折疊成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA。shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)被Dicer切除后產(chǎn)生siRNA，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生基因沉默。慢病毒載體不但可以感染非分裂期細(xì)胞，也可以感染分裂期細(xì)胞，還具有容納外源性目的基因片段大、穩(wěn)定整合持久表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[8]。慢病毒干擾系統(tǒng)是目前應(yīng)用較多的一種RNAi體系。為探討myocardin在VSMCs表型轉(zhuǎn)變中的表達(dá)及作用，我們遵從RNAi設(shè)計(jì)的一般原則[9-12]，設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)大鼠myocardin 3個(gè)不同的靶點(diǎn)shRNA序列和1個(gè)陰性對(duì)照shRNA序列，并利用BLAST進(jìn)行查詢，確定其為特異性序列，合成的DNA兩端設(shè)計(jì)有AgeI或EcoR I 酶切位點(diǎn)及黏端。將合成的雙鏈shRNA通過(guò)DNA連接酶連接入慢病毒干擾空載體(pGCSIL - GFP)，經(jīng)抗性基因篩選，PCR和克隆測(cè)序證實(shí)了目的序列正確連接入克隆。

為驗(yàn)證設(shè)計(jì)的慢病毒干擾載體能正常工作，我們進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)myocardin的過(guò)表達(dá)載體。Flag是一個(gè)由十幾個(gè)氨基酸組成的蛋白標(biāo)簽，由目的蛋白和標(biāo)簽(tag)共同構(gòu)成的蛋白嵌合體，常標(biāo)記于重組蛋白質(zhì)的氨基端以幫助分析靶蛋白的生物學(xué)功能，用于目的細(xì)胞暫時(shí)不易得到或目的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率非常低基因靶點(diǎn)的篩選[11]。鑒于myocardin整個(gè)CDS堿基近3 000 bp，完整CDS克隆很難得到，根據(jù)文獻(xiàn)[13,14]，我們將Flag標(biāo)記引入myocardin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。我們將一段長(zhǎng)800多bp的CDS序列(已經(jīng)包含設(shè)計(jì)的3條干擾質(zhì)粒序列)合成并克隆入經(jīng)EcoR I和KpnI雙酶切線性化pEGFP - N1 / X124G表達(dá)載體，該表達(dá)載體再接上Flag標(biāo)簽，合成后的過(guò)表達(dá)載體pEGFP - N1 -myocardin形成myocardin - GFP融合蛋白并表達(dá)Flag。合成后的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞后，熒光顯微鏡下見(jiàn)到明顯的綠色熒光，證實(shí)該過(guò)表達(dá)質(zhì)粒正常工作。進(jìn)一步將此myocardin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與不同干擾位點(diǎn)的慢病毒干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)工具細(xì)胞內(nèi)Flag的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)設(shè)計(jì)的3條針對(duì)myocardin的慢病毒干擾質(zhì)粒有2個(gè)位點(diǎn)(#1和#3)具有明顯的敲減效應(yīng)，敲減效率gt;75%。我們選擇了#1質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒的大量包裝，最后得到滴度分別為1×1012TU/L和5×1012TU/L的pGCSIL - GFP - shMyocd和對(duì)照l(shuí)entivirus - GFP - NC病毒載體。

Figure 4. Myocardin lentiviral RNAi vector attenuated myocardin expression in VSMCs accompanied with the decrease of SM22α expression.A: RT - PCR；B: Western blotting. Mock: pGCSIL - GFP empty vector；siRNA: pGCSIL - GFP - shMyocd；NC: pGCSIL - GFP - NC.

將#1干擾病毒轉(zhuǎn)染VSMCs后，發(fā)現(xiàn)其顯著下調(diào)VSMCs中myocardin的表達(dá)，同時(shí)伴隨VSMCs分化標(biāo)志物SM22α的表達(dá)顯著下降。提示該myocardin慢病毒干擾質(zhì)粒能正常工作。SM22α是VSMCs典型的收縮標(biāo)志物，其啟動(dòng)子區(qū)域含多個(gè)CArG序列。Myocardin與SRF形成三聯(lián)復(fù)合物后，能調(diào)控具有CArG序列心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞基因的表達(dá)[3]。當(dāng)共轉(zhuǎn)染外源性SRF和myocardin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，VSMCs中包括SM22α在內(nèi)的收縮標(biāo)志物表達(dá)明顯增加[15]，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向VSMCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中也伴隨myocardin及SM22α在內(nèi)的收縮標(biāo)志物表達(dá)的增加[16]，因而提示myocardin在VSMCs分化過(guò)程起重要作用。我們前期的結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)[6,7]。

VSMCs是一種表型可塑性細(xì)胞。在動(dòng)脈粥樣硬化、血管損傷后內(nèi)膜增生、低氧性肺動(dòng)脈重塑等血管疾病中VSMCs由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型。鑒于myocardin在VSMCs分化中的重要作用，預(yù)示著基于myocardin靶點(diǎn)對(duì)涉及VSMCs表型轉(zhuǎn)化性血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等血管重塑性疾病進(jìn)行分子治療的可能性。本研究中有關(guān)pGCSIL- GFP - shMyocd重組質(zhì)粒的構(gòu)建為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

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ConstructionofalentiviralRNAinterferencevectortargetingratmyocardinanditseffectonvascularsmoothmusclecelldifferentiation

JIE Wei1, 2, SHEN Zhi-hua1, WANG Xiao-yan2, KUANG Dong2, WANG Guo-ping2, AO Qi-lin2

(1DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalScience,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;2InstituteofPathology,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceamp;Technology,Wuhan430030,China.E-mail:Aoqilin@126.com)

AIM: To construct a lentiviral RNA interference(RNAi)vector targeting rat myocardin mRNA and to investigate its effect on the differentiation of vascular smooth muscle cells(VSMCs).METHODSThree pairs of dsDNA targeting rat myocardin mRNA were designed, synthesized and cloned into lentiviral vector pGCSIL-GFP to generate pGCSIL-GFP-shMyocd lentvirus. A Flag-tagged myocardin-overexpression vector pEGFP-N1-Myocd was constructed with pEGFP-N1/X124G. After these two vectors were cotransfected into 293T cells, the flag protein was assessed by Western blotting to analyze the knockdown effect of pGCSIL-GFP-shMyocd. The expression of myocardin and SM22α was also detected by RT-PCR and Western blotting after the pGCSIL-GFP-shMyocd viruses were transfected into primary cultured rat aortal VSMCs.RESULTSThe rat myocardin lentviral RNAi vector pGCSIL-GFP-shMyocd and myocardin-overexpression vector pEGFP-N1-Myocd were successfully constructed. After these two kinds of vectors were cotransfected into 293T cells,the No.1 interfering vector displayed the highest inhibitory effect on flag expression.After the No.1 lentvirus at the titer of 1×1012TU/L was transfected into VSMCs, the myocardin and SM22α expression was significantly attenuated.CONCLUSIONThe lentiviral pGCSIL-GFP-shMyocd RNAi vector is successfully constructed, which is useful for further study regarding the molecular mechanism of the phenotypic switching in VSMCs under special pathological conditions such as atherosclerosis. Inhibition of myocardin expression in VSMCs leads to the decrease in the expression of differentiation marker, and implies a crucial role of myocardin in VSMCs differentiation.

Myocardin; Vector construction; Lentivirus; Vascular smooth muscle cells; Cell differentiation

1000-4718(2011)04-0823-06

R329.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.040

2010-09-30

2011-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30400192)

△通訊作者Tel：027-83650551；E-mail: Aoqilin@126.com