中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院(110001) 王雪梅 王 敏

作者:王雪梅，中國醫(yī)科大學(xué)研究生在讀，現(xiàn)工作單位沈陽市婦嬰醫(yī)院。

Dicer是一個(gè)相對分子質(zhì)量約200000的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，是miRNA的形成過程中需要作為RNaseⅢ家族成員的一種關(guān)鍵酶。在產(chǎn)生miRNA的生物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。通過與靶mRNA特異的堿基配對，引起靶mRNA降解或者翻譯抑制，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默。Dicer與腫瘤的關(guān)系已在多種腫瘤中得到證實(shí)，現(xiàn)就Dicer與腫瘤的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Dicer的結(jié)構(gòu)

Dicer是一個(gè)相對分子質(zhì)量約200000的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，通常含有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，它們是:1個(gè)RNA解旋酶-DEXH盒子、1個(gè)含結(jié)合 dsRNA折疊的DUF283、1個(gè)結(jié)合dsRNA末端的折疊的DUF283、1個(gè)結(jié)合dsRNA末端的PAZ、2個(gè)RIII和1個(gè)dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于構(gòu)成RNA沉默復(fù)合物的Argonaute(Ago)蛋白質(zhì)家族中.事實(shí)上，PAZ就取名于3個(gè)主要的Ago蛋白質(zhì)，即Piwi、Ago和Zwille。賈第蟲Dicer僅有1個(gè)PAZ、2個(gè)RIII結(jié)構(gòu)域[1]，比哺乳動(dòng)物Dicer要小得多，但在體外卻有正常的裁剪活性。對賈第蟲Dicer晶體結(jié)構(gòu)的研究揭示了Dicer制造確定長度小RNA的機(jī)制:Dicer的晶體結(jié)構(gòu)外形象短柄斧，2個(gè)RIII結(jié)構(gòu)域構(gòu)成刃部，PAZ結(jié)構(gòu)域構(gòu)成柄端，之間通過長α螺旋相連，相距約65?，相當(dāng)于25ntRNA 的長度[2]。

哺乳動(dòng)物中只存在一種 Dicer[1]，它同時(shí)負(fù)責(zé)miRNA和 siRNA的產(chǎn)生。其中，miRNA的產(chǎn)生過程首先是pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha-DGCR8復(fù)合體切割成60～70nt的pre-miRNA，然后再被細(xì)胞質(zhì)中的Dicer-TRBP復(fù)合體切割成為20～22nt的成熟miRNAs，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有報(bào)道顯示，miRNA可以調(diào)節(jié)大約30%的內(nèi)源基因的表達(dá)[1，3-4]。其中有許多涉及到生物體的生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如生物體的生長發(fā)育，細(xì)胞的死亡和分化等[5]。在生長發(fā)育方面，Dicer通過產(chǎn)生miRNA來調(diào)節(jié)與血管形成有關(guān)基因如let-7family、mir-27b的表達(dá)來調(diào)控生物體血管的形成，而且在缺乏Dicer的胚胎干細(xì)胞在發(fā)育早期便發(fā)生了死亡的現(xiàn)象，也就進(jìn)一步證明Dicer在保證生物體的正常生長發(fā)育中不可或缺[6-8]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞方面，Dicer可以影響細(xì)胞的分化，Barbato等[9]發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元有絲分裂后期分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過程中，Dicer表現(xiàn)出優(yōu)先分配到與細(xì)胞分化有關(guān)的高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，并在成熟和生長階段不斷地調(diào)整分布。Dicer除了影響細(xì)胞分化以外還在調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量方面起著很重要的作用，這可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞異染色質(zhì)和著絲粒的形成來完成的，如小雌鼠缺失Dicer的卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中的停滯、無序的紡錘體的出現(xiàn)、染色體配對的缺失，以及在人類無Dicer細(xì)胞中，異染色質(zhì)形成的異常都是很好的證明，加上Chiosea等發(fā)現(xiàn)的Dicer在高癌變區(qū)域與正常表達(dá)水平相比表現(xiàn)出的下調(diào)和一小部分癌細(xì)胞出現(xiàn)了刪除Dicer位點(diǎn)而使Dicer缺失的現(xiàn)象，從另外一個(gè)方面證明，Dicer具有控制細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡的功能[10-12]

2 Dicer與miRNAs

MiRNAs是一類新的、非編碼的、內(nèi)源性小RNAs，長約20～25個(gè)核苷酸?？梢酝ㄟ^抑制蛋白質(zhì)翻譯、剪切mRNA調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。它們被命名為微小RNA(miRNA)。這是一類具有調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)活性的小RNA。在生物的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。miRNA是內(nèi)源性的，從編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄長鏈初始miRNA(primiRNA)，分別在核內(nèi)和胞漿經(jīng)兩步加工形成。miRNAs通過直接剪切靶mRNAs，或者通過完全/不完全與靶mRNAs 3非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合抑制靶mRNAs的翻譯。這些靶mRNAs進(jìn)一步調(diào)控多種生物學(xué)行為，如發(fā)育的進(jìn)程、干細(xì)胞分化 、細(xì)胞凋亡、疾病以及腫瘤發(fā)生[13-16]。Garcia I研究顯示，30% 以上的蛋白編碼基因可能成為miRNAs的靶基因，50% 的miRNA位于腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域或者脆弱的位點(diǎn)[17]，提示miRNA可能在部分腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。

miRNA的產(chǎn)生過程首先是pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha-DGCR8復(fù)合體切割成60～70 nt的pre-miRNA，然后再被細(xì)胞質(zhì)中的Dicer-TRBP復(fù)合體切割成為20～22 nt的成熟miRNAs，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。首先是初期miRNA復(fù)合體(pri-miRNA)被加工成的70個(gè)核苷酸的miRNA前體(pre-miRNA)，然后miRNA前體在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21～25 bp的成熟miRNA。miRNA成熟過程中的連續(xù)分裂，需要2個(gè)RNaseⅢ:Drosha和 Dicer催化[18]，兩者都是特定 dsRNA 的RNA內(nèi)切酶。Drosha主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，有1個(gè)dsRNA識別結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)模體和1個(gè)未知功能的末端。

miRNA的形成過程中需要作為RNaseⅢ家族成員的兩種酶Drosha和Dicer催化。Drosha主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，具有1個(gè)雙鏈RNA結(jié)合域(dsRNA2binding domain，dsRBD)、2個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和1個(gè)功能未知的氨基酸末端延伸區(qū)域。不管pri2miRNA序列及結(jié)構(gòu)如何，Drosha都會(huì)將其分裂成70nt的pre2miRNA，但其切割pre2miRNA的機(jī)理尚不清楚.Dicer酶包含1個(gè)RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、1個(gè) DUF283 結(jié) 構(gòu) 域、1 個(gè) PAZ(Piwi2Argonaute2Zwille)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNaseⅢ域和1個(gè)dsRBD。Dicer比RNaseⅢ家族其他成員多1個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)γ傅墓δ芷鹬匾饔肹19]。

miRNA能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。當(dāng)miRNA與某一基因同源時(shí)，若與該基因mRNA的3，端非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，此時(shí)RISC會(huì)阻止該基因mRNA翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，稱之為翻譯抑制[20]。若與該基因mRNA完全互補(bǔ)結(jié)合，則在RISC核酸內(nèi)切酶Dicer的作用之下，該基因 mRNA就會(huì)被切割降解，達(dá)到基因沉默效應(yīng)，發(fā)揮類似 siRNA的作用[21]。miRNA途徑可能是使干細(xì)胞對外界信號不敏感而導(dǎo)致細(xì)胞周期停止在G/S過渡期的其中一個(gè)機(jī)制。Lee[22]等利用siRNA技術(shù)剔除Hela細(xì)胞中miRNA生成關(guān)鍵酶Dicer的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌基因HMGA2(highmobility group A2)表達(dá)明顯升高，顯示HMGA2表達(dá)可能通過miRNA調(diào)控，并證實(shí)HMGA2在腫瘤發(fā)生中的高表達(dá)可以通過以下2個(gè)途徑:1)染色體移位截?cái)郒MGA2 3 UTR，導(dǎo)致Let-7的靶標(biāo)缺失。2)Let-7表達(dá)降低。然而，Kanellopoulou[23]等最近證實(shí)，缺少Dicer的鼠胚胎干細(xì)胞盡管有異染色質(zhì)不足的現(xiàn)象發(fā)生，但并不引起染色體的數(shù)目或者結(jié)構(gòu)失常，并且注射這些缺少Dicer的胚胎干細(xì)胞到裸鼠中也不會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。因此，Dicer在腫瘤發(fā)生中的作用可能是非直接的，可能是通過其缺失而導(dǎo)致了具有腫瘤抑制因子效應(yīng)的miRNAs的減少起作用的。小鼠Dicer基因的缺失研究表明，這個(gè)基因在哺乳動(dòng)物發(fā)育和干細(xì)胞正常分化、T細(xì)胞發(fā)育、四肢形成的重要性。

3 Dicer與腫瘤

在miRNA途徑中，Dicer的作用至關(guān)重要。miRNA序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性，使其可能作為mRNA編碼蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，對基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控乃至個(gè)體發(fā)育產(chǎn)生重要影響。最近研究表明，Dicer的表達(dá)量的改變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[24-25]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在對皮膚腫瘤的研究中，miRNA生成過程中的重要酶Dicer和Drosha的失調(diào)相對于正常組織是顯著的，因而提出miRNA參與了皮膚上皮性腫瘤發(fā)生的假說。2005年首次證明人類肺癌中Dicer的表達(dá)下調(diào)，并指出其表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后有密切關(guān)系。Karube[26]等發(fā)現(xiàn)，Dicer的表達(dá)量下降與術(shù)后存活期縮短相關(guān)。從而表明了Dicer可能阻止肺組織的轉(zhuǎn)化。由于Dicer與異染色質(zhì)的維持和中心粒沉默有關(guān)，其蛋白質(zhì)水平的降低可能直接導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，從而引起腫瘤形成。此外，在前列腺癌、胃癌、原發(fā)性肝癌、乳腺癌以及頭頸部涎腺癌中均有Dicer表達(dá)情況的相關(guān)研究，但Dicer在各種腫瘤中的表達(dá)并不完全一致。Simion Chiosea[27]等人在前列腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，Dicer蛋白在前列腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于良性前列腺增生組織和正常的前列腺組織，而且與腫瘤的分型、分期和腫瘤侵襲性本身密切相關(guān)，高表達(dá)Dicer的前列腺癌更容易擴(kuò)散、復(fù)發(fā)，患者病死率也高，即在前列腺癌中Dicer高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Zheng Zhihong等[28]報(bào)道，在胃癌的發(fā)展中Dicer的表達(dá)是逐漸下降的，特別是進(jìn)展期胃癌中，并推測這與miRNA的啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)，這也證明了Dicer在腫瘤發(fā)展中起重要作用。在原發(fā)性肝癌的研究中，發(fā)現(xiàn)Dicer mRNA在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)量明顯下降，Dicer蛋白在原發(fā)性肝癌中亦定位于胞漿中，是在胞漿中發(fā)揮功能的一種酶。并且可以初步判定Dicer蛋白在肝癌中的表達(dá)量是增加的。Chen C[29]等人證實(shí)，Dicer基因翻譯水平蛋白的變化與轉(zhuǎn)錄水平mRNA的變化正好相反，說明在原發(fā)性肝癌中Dicer基因在轉(zhuǎn)錄水平到翻譯水平存在某種調(diào)節(jié)放大機(jī)制或存在其他調(diào)節(jié)途徑，使其蛋白水平放大。在體外細(xì)胞的RNAi試驗(yàn)說明，Dicer蛋白在低分化細(xì)胞系中的高表達(dá)與該細(xì)胞的惡性增殖趨勢有關(guān)，而與HBV在該細(xì)胞中的持續(xù)復(fù)制無關(guān)。G Grelier[30]等在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細(xì)胞系McF-7中除去Dicer可以阻滯G1期，還可以增加對DNA損傷劑順鉑的敏感性。所以可以應(yīng)用抗-Dicer方法與傳統(tǒng)的化療去治療乳腺癌。SI Chiosea等[31]在78例上消化道黏液表皮樣癌中研究Dicer蛋白的表達(dá)情況，結(jié)論為Dicer可以作為低生存率的單變量指標(biāo)，其異常表達(dá)與腫瘤的分化高級別及腫瘤處于晚期有關(guān)。Dicer亦是頭頸部黏液表皮樣癌的獨(dú)立預(yù)后因素之一。

關(guān)于婦科腫瘤的研究。Chen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)腫瘤演進(jìn)和化療耐藥卵巢癌中Dicer的表達(dá)與腫瘤臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)，預(yù)后不良的患者Dicer表達(dá)更低。休斯頓德克薩斯大學(xué)腫瘤中心William M.Merritt[33]檢測了111例患者侵襲性上皮卵巢癌標(biāo)本中Dicer和Drosha酶的mRNA的水平，并且分析其與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，Dicer和Drosha酶的mRNA水平和它們相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平是對應(yīng)的。Dicer的低表達(dá)率和腫瘤分期明顯相關(guān)，Drosha的低表達(dá)則與較低的外科(腫瘤細(xì)胞減滅術(shù))治療率有關(guān)，分別為:低表達(dá)Dicer，較高(惡性)分期的病理特征，對化療的低敏感性。Dicer和Drosha基因檢查卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配的變異，但是無論出現(xiàn)或不出現(xiàn)變異都與表達(dá)水平無關(guān)。Pampalakis[34]等研究Dicer在34例卵巢組織中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)得出Dicer胭A在卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)水平與正常及良性腫瘤的表達(dá)水平相比是顯著下調(diào)的。Nam EJ等[35]闡述，miRNA在復(fù)發(fā)性卵巢癌中失調(diào)的機(jī)制，Dicer蛋白在原發(fā)及復(fù)發(fā)的腫瘤之間的表達(dá)區(qū)別還有待研究。

綜上所述，目前Dicer在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及臨床應(yīng)用價(jià)值還不甚清楚，有待更多更深入地研究予以明確。雖然分子生物學(xué)技術(shù)和信息生物學(xué)飛速發(fā)展簡便了研究，但由于腫瘤發(fā)生過程復(fù)雜以及作用方式的網(wǎng)絡(luò)化等均給研究帶來挑戰(zhàn)，因此探索之旅仍將是一條漫長的科學(xué)之路。

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