王 晶，金 磊，熊禮燕，王庭芳, 2，鄭莉萍, 2，張 寧，鄒 豪，張 川

(1．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2．福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；3．上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

HPLC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中丹參素鈉的濃度

王 晶1，金 磊1，熊禮燕1，王庭芳1, 2，鄭莉萍1, 2，張 寧3，鄒 豪1，張 川1

(1．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2．福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；3．上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

目的建立液質(zhì)聯(lián)用色譜法(HPLC-MS/MS)測(cè)定SD大鼠血漿中丹參素鈉的濃度。方法血漿樣品采用液液萃取方法進(jìn)行預(yù)處理。色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)；流速為1.0 ml/min；質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，負(fù)離子檢測(cè)，選擇MRM測(cè)定丹參素鈉和酮洛芬197→135 m/z和253→209 m/z。結(jié)果丹參素鈉在10.6 ～1 060 ng/ml檢測(cè)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 6)，最低定量限為10.6 ng/ml，日內(nèi)和日間精密度的RSD<7.8 %，回收率在99 %到102 %之間。結(jié)論該方法靈敏度高、快速、簡單、準(zhǔn)確，適用于血漿樣品中丹參素鈉的含量測(cè)定以及臨床前實(shí)驗(yàn)研究。

丹參素鈉；HPLC-MS/MS；血藥濃度

丹參來源于唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。丹參有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，防止心肌缺血[1]，促進(jìn)血液循環(huán)[2]，降血脂，消炎抗菌作用[3]。丹參主要分為脂溶性和水溶性成分[4]。水溶性成分中丹參素的含量較高，活性較強(qiáng)，作為丹參的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

丹參素[D(+)-β-(3，4-二羥基苯基)-乳酸]具有抗炎、抗氧化[5]、抗血栓、抗心肌缺血、抗腫瘤[6]等作用，并且能清除自由基和抗氧化[7]，抑制血小板聚集[8]，改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)血脂代謝等作用[9]。常用的檢測(cè)方法有LC-UV[10～12], LC-FLD[13], LC-DAD[14]。本文采用HPLC-MS/MS方法建立了SD大鼠血漿樣品中丹參素鈉的含量測(cè)定方法。

1 材料與儀器

1.1藥品和試劑 丹參素鈉對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，純度99.6 %)，酮洛芬對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，含量95.6 %)，甲醇為美國Merck公司生產(chǎn)的色譜純?cè)噭?，乙酸乙酯為上海勝德化工有限公司生產(chǎn)，甲酸為FEDIA公司，濃鹽酸為國藥集團(tuán)化工有限公司生產(chǎn)，水為去離子水。

1.2儀器 VARIAN 1200L液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括VARIAN ProStar 210高壓泵，VARIAN ProStar 410自動(dòng)進(jìn)樣器，VARIAN 1200L Quadrupole MS/MS儀，VARIAN MS 6.8 工作站。XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，CR3i臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher公司)，thermofisher SPD121減壓離心濃縮(ThermoFisher公司)，HA-202M電子天平(A&D Company LTD)。

2 方法與結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18，(200 mm×4.6 mm，5 μm)柱溫25 ℃ ，流動(dòng)相：甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)，采用等梯度洗脫方式，流速 0.80 ml/min，3:2分流入質(zhì)譜的流速為0.32 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，分析時(shí)間9.0 min。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用氣動(dòng)輔助電噴霧離子化電離源(ESI)，負(fù)離子方式檢測(cè)；噴霧電壓(SP)4700V；加熱毛細(xì)管溫度(TEM)為250 ℃；碰撞氣(CID)壓力1.65 mTorr；源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離(Source CID)能量為18.0 V；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，分別測(cè)定丹參素鈉和酮洛芬反應(yīng)離子m/z 197→135和m/z 253→209；掃描時(shí)間為0.5 s。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 ①丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取丹參素鈉對(duì)照品10.6 mg，用甲醇配制成濃度為1.06 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-80℃保存待用，1個(gè)月后重新配制。②酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo))：精確稱取一定量酮洛芬，用甲醇配制成濃度為102.4 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，-80 ℃保存待用，1個(gè)月后重新配制。

用丹參素鈉對(duì)照品配成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl于90 μl空白血漿中，使丹參素鈉的血漿終濃度分別為10.6、21.2、53、106、212、530、1 060 ng/ml，余同血漿樣品的處理和測(cè)定。

2.3血漿樣品的前處理方法 精密量取血漿樣品100 μl，置于1.5 ml的塑料離心管中，加入50 μl內(nèi)標(biāo)(酮洛芬甲醇溶液，102.4 ng/ml)，渦旋30 s，再加入50 μl的鹽酸溶液(3 mol/L)，渦旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，渦旋3 min, 離心(5000 r/min )10 min分層，取上清800 μl轉(zhuǎn)移至另一1.5 ml塑料離心管中，冷凍離心機(jī)吹干，100 μl流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋1 min，離心(12 000 r/min)10 min，取上清20 μl進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4分析方法的專屬性 按上述LC-MS/MS條件測(cè)得6只SD健康大鼠的空白血漿；空白血漿+丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)樣品+內(nèi)標(biāo)；受試大鼠靜脈注射丹參素鈉后的血漿樣品質(zhì)量色譜圖，見圖1。丹參素鈉與酮洛芬的保留時(shí)間分別為6.7 min和7.0 min，由圖可見血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.5線性范圍與定量限 將不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的丹參素鈉與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，丹參素鈉濃度為橫坐標(biāo)，直線加權(quán)回歸。結(jié)果表明血漿中丹參素鈉濃度在10.6～1 060 ng/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系y=0.003528x-0.031(r=0.999 6)。方法的最低定量限為10.6 ng/ml(S/N>10)，其RSD值為9.8%。

2.6精密度與回收率 按丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備質(zhì)控樣品，對(duì)21.2，106和 848 ng/ml 3種濃度進(jìn)行了連續(xù)3 d的5份樣本分析，以評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)、日間精密度。同時(shí)以流動(dòng)相代替空白血漿，同樣方法配制高、中、低3種濃度(21.2、106、848 ng/ml )的標(biāo)準(zhǔn)樣品，計(jì)算回收率。低、中、高3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度分別為(21.08 ± 1.54)、(106.52 ± 4.12)、(846.04 ± 5.22) ng/ml；日內(nèi)精密度分別為 7.30、3.87、0.64%；日間精密度分別為5.42、3.57、0.55%；提取回收率分別為(100.46 ± 5.44)%、(101.88 ± 3.64)%、(99.11 ± 0.54)%。

2.7分析樣品的穩(wěn)定性 將丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的(21.2、106、848 ng/ml)的血漿樣品，按上述操作進(jìn)行穩(wěn)定性考察：血漿樣品室溫放置2 h的穩(wěn)定性；血漿樣品處理后放置4 h的穩(wěn)定性；室溫與-80 ℃凍融3次的穩(wěn)定性；-80 ℃保存20 d的穩(wěn)定性。每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定5份樣品與放置0 h的樣本進(jìn)行比較，計(jì)算后各濃度變異均小于15%，穩(wěn)定性符合指導(dǎo)原則。

3 討論

3.1血漿樣品前處理方法的選擇 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)嘗試使用蛋白沉淀法，空白血漿中出現(xiàn)干擾或雜質(zhì)，而且提取回收率低，因此選擇回收率高，選擇性好的液液萃取方法，乙酸乙酯作為萃取溶劑。

3.2流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)丹參素鈉色譜行為影響較大，流動(dòng)相中甲醇比例越高，丹參素鈉保留時(shí)間越長，柱效下降，峰形較差。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)時(shí)，丹參素鈉及其內(nèi)標(biāo)物酮洛芬的峰形較好，響應(yīng)強(qiáng)度最大，故選擇甲醇-水(含0.01‰甲酸)=(80:20)為流動(dòng)相。

4 結(jié)論

建立了測(cè)定SD大鼠體內(nèi)丹參素鈉血藥質(zhì)量濃度LC-MS/MS法。血漿中無干擾測(cè)定的內(nèi)源性物質(zhì)，線性范圍為10.6～1 060 ng/ml，定量下限為10.6 ng/ml，批內(nèi)、批間精密度均小于7.8%，回收率在99%～102%之間。該方法靈敏，簡單，準(zhǔn)確，可用于SD大鼠血漿中丹參素鈉的含量測(cè)定及其臨床前試驗(yàn)研究。

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2011-03-01

[修回日期] 2011-03-07

DeterminationofsodiumDanshensuinratplasmabyHPLC-MS/MS

WANG Jing1, JIN Lei1, XIONG Li-yan1, WANG Ting-fang1, 2, ZHENG Li-ping1, 2, ZHANG Ning3, ZOU Hao1, ZHANG Chuan1

(1. New drug research center, School of Pharmcy, Second military medical university, Shanghai 200433, China; 2. School of Pharmacy, Fujian university of traditional Chinese medcine , Fuzhou 350108, China; 3. Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031, China)

ObjectiveTo estiblish a method of determining sodium Danshensu in rat plasma by HPLC-MS/MS.Methodssodium Danshensu was extrated for determination by HPLC-MS/MS. Analytical column was Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm ,5 μm). The mobile phase was methanol:water (0.01‰ formic acid )= 80:20. Mass spectrum conditions were ESI performing in the MRM mode using target ions m/z 197→135 (Sodium Danshensu), m/z 253→209 (ketoprofen).ResultsThe calibration curve was liner over the range of 10.6～1 060 ng/ml. The LLOQ of sodium Danshensu in plasma was 10.6 ng/ml. The intra-day and inter-dayRSDwere<7.8%. The extracted recovery was ranged from 99% to 102%.ConclusionThe method was sensitive, rapid, simple and accurate to sodium Danshensu plasma concertration and suitable to study preclinical test of sodium Danshensu.

sodium Danshensu; HPLC-MS/MS; plamsma concentration

王 晶(1984-)，女，碩士研究生. E-mail:laoer-wangjing@163.com.

張 川. Tel：(021)81871358， E-mail:zhangchuan@smmu.edu.cn.

R92

A

1006-0111(2011)02-0109-03