李艷坤

（華北電力大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 保定 071003）

DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的共振光散射研究及應(yīng)用

李艷坤

（華北電力大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 保定 071003）

在pH 2.21～4.35的Britton-Robinson（BR）緩沖溶液中，脫氧核糖核酸（DNA）與蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，引起較DNA或蛋白質(zhì)單獨(dú)存在時(shí)的共振光散射（RLS）信號的強(qiáng)烈增強(qiáng).用于分析蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的相互作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：DNA與蛋白質(zhì)之間存在較強(qiáng)的靜電相互作用.在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，波長315.0nm處，RLS強(qiáng)度的增強(qiáng)與牛血清白蛋白（BSA）在0.05～1.3μg／mL呈良好的線性關(guān)系，檢出限達(dá)到納克級.該方法不需要任何特殊試劑，快速簡便，建立了蛋白質(zhì)檢測分析的新方法，可用于人血清實(shí)際樣品的測定.

共振光散射；蛋白質(zhì)；脫氧核糖核酸；相互作用

蛋白質(zhì)、核酸是生物大分子的代表，是生物化學(xué)研究的重要對象.蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是許多生命活動的重要組成部分，也是分子生物學(xué)研究的中心問題之一.蛋白質(zhì)參與DNA的復(fù)制、重組、病毒整合和轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞活動［1］.蛋白質(zhì)與DNA相互作用非常復(fù)雜，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物通過蛋白質(zhì)與DNA之間的特異性和非特異性相互作用形成.目前除了凝膠遷移（EMSA）、DNaseⅠ足跡法（DNaseⅠfootprinting）、免疫沉淀法（ChIP）、酵母單雜交技術(shù)［2-4］等經(jīng)典方法，還包括原子力顯微鏡（AFM）、表面等離子共振（SPR）、生物質(zhì)譜技術(shù)、指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化法（Selex）［5-6］等新興方法，在闡明蛋白質(zhì)結(jié)合DNA形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)上已經(jīng)取得不少進(jìn)展.但這些方法大都存在操作步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)成本高等缺點(diǎn).共振光散射（RLS）分析方法是一種能在普通熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行測量的光散射分析技術(shù)，在研究生物大分子識別、組裝和聚集時(shí)出現(xiàn)靈敏而豐富的信號，可取得與常用的熒光法同樣高的靈敏度.共振光散射分析方法不僅可用于生物大分子的定量檢測，而且可用于生物大分子間、生物大分子與其他物質(zhì)之間相互作用機(jī)理的研究［7］.有關(guān)蛋白質(zhì)和核酸種類及其含量的測定在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域中也有著重大的意義和廣泛的應(yīng)用.DNA與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，較DNA或蛋白質(zhì)的體積增大，引起光散射信號的強(qiáng)烈增強(qiáng).目前，共振光散射用于分析DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物方面的文章尚未見報(bào)道.本文利用共振光散射技術(shù)研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，并由此建立了操作簡便、靈敏度高的蛋白質(zhì)檢測分析的新方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；WH-861型旋渦混合器（江蘇太倉市科教器材廠）；pH酸度計(jì)（S-3C，上海偉業(yè)儀器廠）；DNA貯備液：準(zhǔn)確稱量小牛胸腺DNA（ctDNA，Sigma D-1501），直接溶于水配成100μg／mL的溶液，并于0～4℃冰箱中保存；BSA貯備液：準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白（BSA），直接溶于水中配成100μg／mL的溶液，并于0～4℃冰箱中保存；Britton-Robinson（BR）緩沖溶液用于控制溶液的酸度；NaCl儲備液：0.5mol／L.所用試劑均為分析純，所用的蒸餾水全部為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10mL比色管中，依次加入0.7mL 10μg／mL的ctDNA溶液，0.5mL的BR緩沖溶液（pH＝3.78），適量的標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液，每加一種試劑都將體系旋渦混合.最后將試液用二次蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻后于熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行同步掃描（λex＝λem），獲得共振光散射（RLS）光譜，并在315.0nm處測定RLS強(qiáng)度.激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，負(fù)高壓為400V.

2 結(jié)果與討論

2.1 散射光譜

ctDNA（Calf thymus DNA，ctDNA），BSA-ctDNA的RLS光譜如圖1所示.DNA，BSA的水溶液屬于高分子均相溶液，其散射應(yīng)屬于瑞利散射.根據(jù)瑞利散射定律（rayleigh law），在校正儀器特性的影響下，散射光的強(qiáng)度與波長λ的四次方成反比.其溶液的散射是由于它們的濃度漲落引起的，由于DNA，BSA單獨(dú)存在時(shí)，濃度很低，瑞利散射強(qiáng)度太弱，根本不能用作分析測定.但是當(dāng)DNA與BSA處于同一溶液體系中時(shí)，兩者發(fā)生相互作用，形成體積較大的復(fù)合體，此時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射現(xiàn)象.因?yàn)楦鶕?jù)共振光散射理論，粒子體積的增大和強(qiáng)靜電結(jié)合及大結(jié)合數(shù)所導(dǎo)致的高度的電子離域共軛，都會產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射現(xiàn)象.所以，從圖1可以看出，在pH 3.78的BR緩沖溶液中，波長250～700nm，BSA-DNA復(fù)合物的RLS信號比DNA的RLS信號有明顯的增強(qiáng)，并在接近DNA分子吸收譜帶附近315.0nm處產(chǎn)生最大RLS峰.而且RLS強(qiáng)度隨BSA濃度的增大而增強(qiáng)，并在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系.

2.2 BSA和DNA的相互作用

根據(jù)目前各種對蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的復(fù)合物的研究，蛋白質(zhì)與DNA形成復(fù)合物時(shí)能使DNA分子發(fā)生扭曲、拉伸而變形，從而使蛋白質(zhì)更緊密地與DNA接觸［8］.DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基相互交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復(fù)合體（biopolymers）［9］.在DNA與蛋白質(zhì)復(fù)雜的特異性和非特異性相互作用中，蛋白質(zhì)的氨基末端和DNA主鏈骨架上帶負(fù)電的磷酸基（PO22-）產(chǎn)生靜電相互作用，提供結(jié)合能，有利于DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定［10］；此外，還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氨基末端和DNA嘌呤堿基之間有氫鍵存在.

本文考察了溶液處于不同pH時(shí)，BSA與DNA作用的RLS強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示.可以看出，在大約pH＜4.7的酸性范圍內(nèi)，BSA在ctDNA存在下產(chǎn)生很強(qiáng)的RLS信號.由此證明了BSA與DNA之間存在的靜電相互作用.因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的等電點(diǎn)接近pH 4.7，在pH＜4.7時(shí)帶有正電荷，而核酸表面的磷酸基帶有負(fù)電荷，所以二者可以結(jié)合形成復(fù)合體從而產(chǎn)生較強(qiáng)的RLS信號；而當(dāng)pH＞4.7時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，二者之間的靜電作用減弱，RLS信號急劇降低.當(dāng)pH值為3.78時(shí)，BSA的RLS信號增強(qiáng)最大，選定為實(shí)驗(yàn)最佳pH值.

同時(shí)通過向體系中加入不同濃度的NaCl溶液，考察了離子強(qiáng)度對DNA-BSA相互作用的影響.在10mL比色管中，使DNA質(zhì)量濃度為0.7μg／mL，BSA質(zhì)量濃度為1.0μg／mL，BR（pH 3.78）緩沖溶液0.5mL，然后分別加入NaCl溶液，使稀釋后的NaCl溶液的最終濃度分別為0.001，0.01，0.1mol／L.經(jīng)考察后發(fā)現(xiàn)，溶液中NaCl為0.001，0.01mol／L時(shí)，體系的RLS強(qiáng)度基本不變.然而當(dāng)NaCl為0.1mol／L時(shí)，體系的RLS強(qiáng)度急劇降低了22%；DNA-BSA復(fù)合物在高的離子強(qiáng)度下遭到破壞，表明了在DNA與蛋白質(zhì)各種復(fù)雜的相互作用中，蛋白質(zhì)的氨基酸殘基和DNA磷酸基團(tuán)發(fā)生的靜電相互作用是主要因素.

圖1 共振光散射譜Fig.1 Resonace light-scattering spectra

圖2 不同pH下BSA-DNA的RLS強(qiáng)度Fig.2 RLS intensity of BSA-DNA with different pH values

2.3 基于DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)分析方法

2.3.1 DNA質(zhì)量濃度的影響

在pH 3.78的BR緩沖溶液中，保持BSA的質(zhì)量濃度1.0μg／mL不變，ctDNA質(zhì)量濃度變化與RLS強(qiáng)度的變化特征如圖3所示.可以看出，最初隨著ctDNA質(zhì)量濃度的增大，RLS強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)ctDNA質(zhì)量濃度大于0.7μg／mL后，隨著ctDNA質(zhì)量濃度的增大，RLS強(qiáng)度反而逐漸減小.根據(jù)對DNA凝聚的理論研究［11-12］，在此DNA與蛋白質(zhì)的相互作用應(yīng)該經(jīng)歷2個階段：首先，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成大的凝聚體，蛋白質(zhì)的氨基和DNA的磷酸基之間的靜電作用，促使DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定；當(dāng)2者達(dá)到一定的化學(xué)結(jié)合計(jì)量比后，隨著DNA質(zhì)量濃度的增大，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物鏈開始結(jié)合另一條DNA鏈，DNA表面的磷酸基所帶電荷逐漸被中和而變?yōu)殡娭行?，?dǎo)致DNA從溶液中沉淀出來，所以RLS強(qiáng)度逐漸減小.ctDNA質(zhì)量濃度為0.7μg／mL時(shí)，RLS強(qiáng)度達(dá)到最大值.所以選擇0.7μg／mL的ctDNA質(zhì)量濃度為測定蛋白質(zhì)含量的最佳濃度.

2.3.2 BR緩沖溶液用量的影響

在體系中分別加入BR緩沖溶液（pH 3.78）0.25，0.5，1.0，1.5，2.0mL，考察BR緩沖溶液用量對RLS強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示.可以看出，當(dāng)BR緩沖溶液用量小于1.5mL時(shí)，ctDNA的RLS強(qiáng)度隨BR緩沖溶液用量的增加而增強(qiáng)，ctDNA-BSA的RLS強(qiáng)度基本不變；當(dāng)BR緩沖溶液用量大于1.5mL時(shí)，由于溶液中離子強(qiáng)度的增大，BSA與DNA表面的磷酸基之間的靜電作用減弱，所以RLS強(qiáng)度減弱.當(dāng)加入0.5mL BR緩沖溶液時(shí)，ctDNA-BSA的RLS信號增強(qiáng)最大，所以選擇在10mL比色管中加入BR緩沖溶液0.5mL.

圖3 不同DNA質(zhì)量濃度下BSA-DNA的RLS強(qiáng)度Fig.3 RLS intensity of BSA-DNA with different DNA concentrations

圖4 不同體積BR溶液下BSA-DNA的RLS強(qiáng)度Fig.4 RLS intensity of BSA-DNA with different volumes of BR solution

2.3.3 光譜穩(wěn)定性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，ctDNA與BSA混合后立即進(jìn)行測定.發(fā)現(xiàn)1h內(nèi)，RLS強(qiáng)度隨時(shí)間增大.1h后，RLS強(qiáng)度趨于穩(wěn)定不變.所以實(shí)驗(yàn)中將混勻后的待測液放置1h后進(jìn)行測定.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在以上確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法，研究了BSA的質(zhì)量濃度與增強(qiáng)的RLS信號（ΔI）之間的關(guān)系，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示.結(jié)果表明，BSA在0.05～1.3μg／mL有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔI＝ -1.92＋82.7ρ，線性相關(guān)系數(shù)為0.9990，檢出限為11.0ng／mL，表明該方法具有很高的靈敏度.

圖5 不同BSA質(zhì)量濃度與增強(qiáng)的RLS信號關(guān)系Fig.5 Relationships between BSA concentrations and enhanced RLS intensity

2.3.5 干擾測定

考察了常見的金屬離子和氨基酸對測定1.0μg／mL BSA的干擾情況，結(jié)果列于表1.從表1數(shù)據(jù)可以看出，DL-蘇氨酸和L-谷氨酸干擾較大.即使如此，它們的允許濃度也高于在生物體內(nèi)的濃度.其他氨基酸和金屬離子的干擾較小.所以，RLS方法用于BSA的分析測定，其他共存物質(zhì)的干擾很小，表明該方法具有很好的選擇性.

表1 共存物質(zhì)的干擾Tab.1 Tolerance of foreign substances

2.3.6 不同蛋白質(zhì)的響應(yīng)差別

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測定了1.0μg／mL的不同蛋白質(zhì)的RLS信號，并與相同實(shí)驗(yàn)條件下BSA的RLS值進(jìn)行比較，結(jié)果列于表2.由表2可知，各蛋白質(zhì)響應(yīng)信號的大小基本符合它們相對分子質(zhì)量大小的順序，也就是說該分析方法的響應(yīng)信號主要取決于蛋白質(zhì)體積的大小，這與共振光散射理論是相符合的.

表2 不同蛋白質(zhì)的響應(yīng)值Tab.2 Variation between different proteins

2.3.7 人血清試樣中總蛋白含量的測定

用新鮮的人血清樣品（由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院提供）經(jīng)稀釋后，同時(shí)用RLS方法和考馬斯亮藍(lán)法（CBB G-250）進(jìn)行測定，結(jié)果列于表3.從RLS方法分別對2個樣品重復(fù)3次測量結(jié)果的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）可以看出，RLS分析方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測定.

表3 人血清樣本中蛋白含量檢測Tab.3 Assay of proteins in human serum

3 結(jié)論

基于蛋白質(zhì)與DNA相互作用形成復(fù)合物引起共振光散射信號增強(qiáng)的現(xiàn)象，對蛋白質(zhì)與DNA之間較強(qiáng)的相互作用進(jìn)行了研究，并通過對牛血清白蛋白（BSA）的定量檢測，建立了操作簡便、靈敏度高的蛋白質(zhì)檢測分析的新方法，用于人血清實(shí)際樣品的測定取得好的效果.

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Study on the Combination of DNA with Protein by Resonance Light Scattering Technique and Its Analytical Application

LI Yan-kun
（College of Environment Science and Engineering，North China Electric Power University，Baoding 071003，China）

Proteins bind DNA to form a complex，which is bigger than DNA or proteins，leading to strong enhancement of resonance light scattering（RLS）intensity.Based on this，the complex of proteins with DNA results in strong enhancement of resonance light scattering（RLS）intensity in a Britton-Robinson（BR）buffer（pH 2.21-4.35）.The experimental results showed the strong electrostatic binding force between proteins and DNA.Under the optical conditions，the enhanced RLS intensity at 315.0nm was proportional to the concentration of BSA in the range of 0.05-1.3μg／mL.The limit of determination for BSA was obtained at nanogram level.The method doesn't need any special reagents，and a sensitive and convenient new analysis method for microdetermination of proteins is accordingly established.The method has been applied to the assay of proteins in actual human serum sample.

resonance light scattering；proteins；deoxyribonucleic acid；interaction

O 657.3

A

1000-1565（2011）05-0502-06

2010-11-20

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（B2011502061）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（09QL52）

李艷坤（1977-），女，河北大名人，華北電力大學(xué)講師，博士，主要從事光譜分析研究.

E-mail：lyk800＠tom.com

梁俊紅）