李延輝 吳 偉 于艷秋

siRNA干擾 HIF-1α表達(dá)對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的影響

李延輝 吳 偉＊于艷秋1

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科,沈陽110001;1中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,沈陽110001)

目的 研究胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)和缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia induciblefactor 1a,HIF-1a)在高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞中的表達(dá)及其之間的關(guān)系;觀察siRNA沉默HIF-1a基因?qū)Ω咛歉咭葝u素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。方法 新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后,換用無血清DMEM培養(yǎng)液并分別加入高糖高胰島素、高糖高胰島素+HIF-1a-siRNA培養(yǎng)48h,未加入任何藥物的心肌細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48h作為對照。通過心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量指標(biāo)檢測心肌細(xì)胞肥大,并利用Real time PCR檢測轉(zhuǎn)染前后HIF-1a mRNA表達(dá)變化及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測 HIF-1a及IRS1蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果 高糖高胰島素可增加心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量、HIF-1a mRNA以及 HIF-1a表達(dá),并降低IRS1表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA后使 HIF-1a基因的表達(dá)下降,能部分抑制心肌細(xì)胞的肥大,降低心肌細(xì)胞表面積和總蛋白含量,但對IRS1表達(dá)的影響不明顯。在對正常對照組和高糖高胰島素組中IRS1表達(dá)量與 HIF-1a表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析表明,兩者的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)。結(jié)論 通過siRNA技術(shù)對 HIF-1a的有效沉默可明顯地抑制高糖高胰島素誘導(dǎo)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大,并且這種作用可能是通過作用于IRS1/PI3K/Akt/M TOR途徑來實(shí)現(xiàn)的。

缺氧誘導(dǎo)因子1a(HIF-1a); RNA干擾; 胰島素受體底物1(IRS1); 高糖高胰島素; 心肌細(xì)胞肥大

糖尿病心肌病(Diabetes cardiomyopathy,DCM)是高糖直接侵蝕心肌的結(jié)果,是獨(dú)立于冠心病和高血壓以及其他心肌病變的心臟病,其自然病史是一個(gè)潛在的亞臨床期,在這期間心肌細(xì)胞逐漸受到侵蝕,緩慢地出現(xiàn)心肌纖維化和心肌肥厚。在心肌肥厚過程中,高糖高胰島素血癥誘導(dǎo)作用與心肌細(xì)胞蛋白的合成及心肌細(xì)胞肥大密切相關(guān)[1-4],但其中發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚不完全清楚。最近資料表明胰島素可通過激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)增加缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1a)的蛋白表達(dá)水平[5,6],而 HIF-1a表達(dá)增多與高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大之間的關(guān)系尚不明確。本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,在高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的基礎(chǔ)上,應(yīng)用siRNA沉默 HIF-1a基因,觀察心肌細(xì)胞肥大變化情況,并且通過與胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)進(jìn)行相關(guān)分析,探討 HIF-1a基因在高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大時(shí)表達(dá)變化及其與IRS1的相關(guān)性。

材料和方法

1.主要試劑

胰蛋白酶(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?,胰島素、葡萄糖、Ⅱ型膠原酶(sigma),胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)液(hyclone),BCA蛋白定量試劑盒、兔抗大鼠 HIF-1a多克隆抗體、免疫組化SABC試劑盒(武漢博士德工程有限公司),兔抗大鼠IRS1多克隆抗體(北京博奧森公司),兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白I(c TnI)抗體(Santa Cruz),FITC標(biāo)記羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),trizol試劑(invitrogen),real time-PCR試劑盒(Ta KaRa),HIF-1a的 引 物 F:5’CACTGGTGGCTCA GCA GTCTA-3’,R:5’GGA GCTGTGAA TGTGCTGTGA-3’磷酸核糖體磷蛋白 PO(Arbp)F:5’CAGA TGGA TCGGCCA GGAA-3’,R:5’GCGTCTGT CTGCA GA TTGGCTA-3’(上海生工生物有限公司),針對 HIF-1a的siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,基因序列為:sense 5’GCCUCUUCGACAA GCUUAA TT 3’,anti-sense5’UUAA GCUU GUCGAA GA GGCTT 3’。脂質(zhì)體Lipofectamine2000為 Invitrogen公司產(chǎn)品。

2.動物

1-2d的 Wistar大鼠乳鼠,雌雄不拘,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取1-2d的 Wistar大鼠乳鼠5只,無菌條件下開胸取出心臟,用預(yù)冷的D-Hanks液洗滌1遍,然后將心臟的心室分離下來,再用預(yù)冷的D-Hanks液洗滌2遍,剪成約lmm3碎塊,加入 4-5倍體積的0.06%的胰酶并放入37℃恒溫振蕩水浴箱中,震蕩(頻率:75r/min)消化心肌組織7.5min,第一次消化后自然沉淀并棄上清,并用D-Hanks液洗滌1遍,然后從第二次開始用0.08%Ⅱ型膠原酶消化四次,每次消化時(shí)間為7.5min,消化前后各吹打20次左右,自然沉淀后,吸出每次分離的上清液加等量含lO%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液,吸入兩個(gè)15ml離心管中,經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾,然后4℃850r/min離心8min,離心后,棄掉上清,各加入1.5ml培養(yǎng)液,輕輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液,并將兩個(gè)細(xì)胞懸液混合,放入六孔板的兩個(gè)孔中,再放CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60min后,同樣方法再次分別放入6孔板的另兩個(gè)孔中,前2d滴入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)使其終濃度為 0.1mmol/L,并繼續(xù)培養(yǎng),24h、48h都進(jìn)行換液。

3.2 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)48h后,將配制的siRNA-Lip混合液加入含有細(xì)胞和轉(zhuǎn)染液的孔(6孔板或24孔板)中,使每孔轉(zhuǎn)染總體積為lml(六孔板)和0.5ml(24孔板),37℃培養(yǎng)6h;換新鮮含高糖高胰島素培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)48h。

3.3 細(xì)胞分組

正常對照組:(A組,不加入任何處理因素,5.5mmol/L葡萄糖);高糖高胰島素培養(yǎng)組(B組,25.5mmol/L葡萄糖+10-7mmol/L胰島素);干擾組:高糖高胰島素+HIF-1a-siRNA培養(yǎng)組(C組,含siRNA-Lip混合液的DMEM高糖高胰島素培養(yǎng)液)、脂質(zhì)體對照組(含Lip-2000的DMEM高糖高胰島素培養(yǎng)液)、陰性錯(cuò)配對照組(含Lip-2000的DMEM高糖高胰島素培養(yǎng)液加錯(cuò)配的siRNA),分別作用48h后備測。

4.心肌細(xì)胞肥大檢測

4.1 心肌細(xì)胞面積測定

取24孔板中有心肌細(xì)胞生長的玻片,預(yù)冷DHanks液漂洗血清及雜質(zhì),4%多聚甲醛固定15min,利用細(xì)胞免疫熒光法,得心肌細(xì)胞免疫熒光照片后,用MetaMorp h/DP10/BX41醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(US/JP,UIC/OL YMPUS公司)測量單個(gè)細(xì)胞表面積,每張玻片測5個(gè)視野,每個(gè)視野測l0-l5個(gè)細(xì)胞,取其平均值。每組重復(fù)3次。

4.2 心肌細(xì)胞蛋白含量測定

收集六孔板內(nèi)各組細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)每孔心肌細(xì)胞數(shù),沉淀細(xì)胞后加入2-3倍體積的細(xì)胞裂解液,使心肌細(xì)胞膜溶解,離心后吸取上清,用BCA法測定心肌細(xì)胞蛋白含量。

5.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (Real-Time Poly-merase Chain Reaction,Real-Time PCR)檢測HIF-1a mRNA的表達(dá)

5.1 RNA的提取及cDNA的合成

用六孔板培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行總 RNA提取(參照 Trizol試劑盒說明逐步操作),成功提取后,用紫外分光光度計(jì)測定波長260nm和280nm處吸光度值,計(jì)算A260/A280比值(OD值),確定 RNA的含量、濃度和純度。

5.2 Real-Time PCR

參照Real-Time PCR試劑盒要求的條件對提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),均采用10μl反應(yīng)體系,所得cDNA用于 PCR擴(kuò)增,取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,使用 TP800 Real-Time PCR儀(Ta KaRa公司),按照試劑說明書提供的參考用量及終濃度范圍,制備PCR反應(yīng)混合液。用25μl反應(yīng)體系,以最佳 PCR條件,具體如下:95℃,5min;40個(gè) PCR循環(huán)(95℃,10s;60℃,20s;72℃,20s;79℃,20s(收集熒光))。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,(95℃,2min;60℃,20s;72℃,20s;99℃,15s,并從72℃緩慢加熱到99℃(8min),PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果,再由 PCR儀采集、分析熒光信號,自動生成熒光強(qiáng)度曲線,計(jì)算反應(yīng)體系中待測基因 HIF-1a及管家基因Arbp的Ct值。計(jì)算方法采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法,求出目的基因的相對含量。每組2個(gè)復(fù)孔(每孔重復(fù)3次)。

6.細(xì)胞免疫組化檢測HIF-1a和IRS1的蛋白表達(dá)

取24孔板中有心肌細(xì)胞生長的玻片,按照SABC試劑盒說明進(jìn)行,HIF-1a和IRS1抗體滴度都為1:150,DAB顯色。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 17.0計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,方差齊者用LSD檢驗(yàn),方差不齊者用 Games-Howell檢驗(yàn);相關(guān)分析數(shù)據(jù)采用person相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HIF-1α-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞面積的影響

各組間加入不同處理因素48h后,利用細(xì)胞免疫熒光法,得心肌細(xì)胞圖形,測各孔細(xì)胞表面積,以對照組心肌細(xì)表面積作為100%,高糖高胰島素培養(yǎng)組的心肌細(xì)胞的表面積(134±15)%與對照組相比顯著增加(P<0.01),加入 HIF-1a-siRNA的干擾組的心肌細(xì)胞表面積(110±7)%與高糖高胰島素培養(yǎng)組的心肌細(xì)胞表面積相比明顯降低(P<0.01),與對照組相比仍有增高(P<0.01)(見圖1、表1)。

表1 HIF-1a-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞的表面積和蛋白含量的影響(ˉx±s)Table 1 Effects of HIF-1a-siRNA on the Cell surface area and protein levelof hypertrophic cardiomyocytes of neonatal rats induced by high glucose and high insulin(ˉx ±s)

2.HIF-1α-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞蛋白含量的影響

同上加入不同處理因素48h后,用BCA蛋白定量法測定蛋白含量(以104個(gè)細(xì)胞為測量單位)。與正常對照組相比,高糖高胰島素培養(yǎng)組心肌細(xì)胞蛋白含量增加37.4%(P<0.01),與高糖高胰島素組相比,加入 HIF-1a-siRNA的干擾組的心肌細(xì)胞蛋白含量減少24.3%(P<0.01),但與對照組相比仍增高13.1%(P<0.01)(見表1)。

3.HIF-1α-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞HIF-1a mRNA的影響

同上加入不同處理因素48h后,用 Real-Time PCR方法對 HIF-1a mRNA進(jìn)行定量分析(采用相對量表示)。與正常對照組相比,高糖高胰島素培養(yǎng)組心肌細(xì)胞中 HIF-1a mRNA量增加2.26(P<0.01),與高糖高胰島素組相比,加入 HIF-1a-siRNA的干擾組的心肌細(xì)胞中HIF-1a mRNA量減少1.72(P<0.01),但與對照組相比,仍增高 0.54(P<0.01)(見表 1,圖 2)。

圖1 不同處理因素下心肌細(xì)胞中 HIF-1α表達(dá)的情況(×400)Fig.1 Effects of Different factors on HIF-1αof hypertrophic cardiomyocytes of neonatal rats(×400).

4.HIF-1α-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞 HIF-1a及IRS-1表達(dá)的影響

同上加入不同處理因素48h后,用細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法對 HIF-1a及IRS-1蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。與正常對照組相比,高糖高胰島素培養(yǎng)組心肌細(xì)胞中 HIF-1a蛋白表達(dá)量增加 4.407%(P<0.01),而 IRS-1蛋白表達(dá)量減少 1.006%(P<0.01),與高糖高胰島素組相比,加入 HIF-1α-siRNA的干擾組的心肌細(xì)胞中 HIF-1a減少2.057%(P<0.01),而 IRS-1 減少 0.004%(P>0.05),但與對照組相比,HIF-1a蛋白表達(dá)量仍增高2.35%(P<0.01),IRS-1蛋白表達(dá)量仍有減少1.01%(P<0.01)(見圖 3、表 2)。

圖2 Realtime PCR產(chǎn)物 HIF-1a(169bp)和 Arbp(127bp)的凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Results of real time PCR products of HIF-1a(169bp)and Arbp(127bp)of the gel electrophoresis

圖3 不同處理因素下心肌細(xì)胞中IRS-1表達(dá)的情況Fig.3 Effects of Different factors on IRS-1 of hypertrophic cardiomyocytes of neonatal rats(×400)

表2 HIF-1α-siRNA對高糖高胰島素誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞 HIF-1a及IRS-1表達(dá)平均光密度的影響(ˉx±s)Table 2 Effects of HIF-1a-siRNA on average optical density of HIF-1a and IRS-1 of hypertrophic cardiomyocytes of neonatal rats induced by high glucose and high insulin(ˉx ±s)

5.心肌細(xì)胞中 HIF-1a與 IRS1相關(guān)性分析在正常對照組與高糖高胰島素培養(yǎng)組兩組中,心肌細(xì)胞中HIF-1a表達(dá)含量明顯與IRS-1表達(dá)含量表達(dá)成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.915。

討 論

DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚不十分清楚,如何采取針對性的干預(yù)措施,降低糖尿病患者DCM的發(fā)病率和提高患者的生存質(zhì)量,是今后國際上研究的熱點(diǎn)之一。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)[3],在DCM發(fā)生心肌細(xì)胞肥大過程中高糖高胰島素具有重要的作用,然而高糖高胰島素引起心肌肥大的作用機(jī)制尚不明確。這種高血糖的代謝變化可能與胰島素受體底物(Insulin receptor substrate,IRS)/磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinos-itol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,m TOR)信號途徑有一定關(guān)系[6,7],此信號途徑中的m TOR可通過p70s6k的磷酸化狀態(tài)而啟動翻譯過程進(jìn)而促進(jìn)多種蛋白表達(dá)包括 HIF-1a[8]。這些蛋白表達(dá)的變化將暗含著心肌將從適應(yīng)性的心肌肥厚到心臟衰竭,影響心臟功能[9,10]。Laughner[11]等研究表明,常氧時(shí)PI3K/Akt/m TOR對 HIF-1a的誘導(dǎo)與缺氧對 HIF-1a的誘導(dǎo)不同,可能是通過增加 HIF-la的蛋白合成,而不是通過抑制 HIF-1a的降解實(shí)現(xiàn)的。在IRS/PI3 K/Akt/m TOR這條信號途徑中,IRS包括 IRS-1、IRS-2、IRS-3和 IRS-4,其中 IRS-1最為重要,它作為碼頭蛋白結(jié)合和激活包括胰島素在內(nèi)的信號傳導(dǎo)分子,它是胰島素與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的一個(gè)重要介質(zhì),特別是在胰島素代謝效應(yīng)方面(促進(jìn)肌肉、脂肪組織攝取利用葡萄糖),它起了主要作用,同時(shí)在調(diào)節(jié)胰島素分泌過程中它也起到了主要作用[12]。

研究結(jié)果顯示,HIF-1a-siRNA可部分抑制由高糖高胰島素引起的心肌細(xì)胞肥大,這是由于 HIF-1a-siRNA抑制了 HIF-1a的表達(dá),進(jìn)而可能減少HIF-1a誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。在A和B組中,HIF-1a表達(dá)增多,而IRS-1表達(dá)減少,兩者存在一定的負(fù)相關(guān)性,表明 IRS-1是其上游信號點(diǎn),可能通過而IRS/PI3K/Akt/m TOR途徑調(diào)控的 HIF-1a表達(dá)。還有,高糖高胰島素刺激下,IRS-1表達(dá)減少,而HIF-1a表達(dá)增多可能與胰島素抵抗有關(guān)。在2型糖尿病患者中,高血糖通過IRS-1的酪氨酸磷酸化抑制細(xì)胞內(nèi)IRS-1蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制了胰島素信號傳導(dǎo),引起胰島素抵抗。而有人通過實(shí)驗(yàn)對此提出異議,特異性地破壞IRS-1的老鼠僅表現(xiàn)輕度胰島素抵抗,不表現(xiàn)明顯的糖尿病,這些提示 IRS-1在胰島素代謝信號傳遞中不起作用,輔助通路可能代償 IRS-1的缺乏[13]。本實(shí)驗(yàn)表明,IRS-1/PI3K/Akt信號通路可能參與了與 HIF-1a表達(dá)增加有關(guān)的心肌肥大反應(yīng)過程;HIF-1a-siRNA可能通過上述途徑抑制了胰島素所致心肌肥大作用從而降低了心肌細(xì)胞的表面積和總蛋白含量?？傊?高糖高胰島素所致心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制與其有關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系非常復(fù)雜。因此,與其相關(guān)的信號通路在心肌細(xì)胞肥大發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚需深入研究。

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Effect of HIF-1α-siRNA on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose and insulin in neonatal rats

Li Yanhui,Wu Wei﹡,Yu Yanqiu1
(Department of Emergency,The Af f iliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001;1Department of Pathophysiology,Basic Medical College,China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective The expression of insulin receptor substrate 1(IRS1)and hypoxia inducible factor 1a(HIF-1a)in myocardial hypertrophy induced by high glucose and insulin as well as their relationship were studied;The effect of siRNA silencing HIF-1a gene on such cardiomyocyte hypertrophy was observed.Methods Cardiomyocytes of neonatal rats were cultured for 48 hours,and then treated with high glucose plus high insulin or high glucose plus high insulin plus HIF-1a-siRNA in serum f ree DM EM for another 48 hours,w hile control cardiomyocytes were continuously cultured in serum f ree DM EM for another 48 hours.Cardiomyocyte hypertrop hy was determined by myocardial cell surface area and total protein content.HIF-1a mRNA was examined by real time PCR,and the expressions of HIF-1a and IRS1 proteins were detected by immunocytochemistry.Results The cellular surface area,total protein content,HIF-1a and HIF-1a mRNA were significantly increased af ter treatment with high glucose and insulin compared with those of the controls,while IRS1 was significantly decreased.Af ter HIF-1a-siRNA was transfected to cardiac cells of neonatal rats,the cellular surface area and total protein content were decreased,but IRS1 was not significantly affected.The expressions of HIF-1a and IRS1 showed a negative correlation in the control group and the group of high glucose and insulin.Conclusion The application of siRNA targeting HIF-1a can effectively lessen cardiac hypertrophy of neonatal rats induced by high glucose and high insulin,and this effect may be achieved by acting on the IRS1/PI3K/Akt/MTOR pathway.

Hypoxia inducible factor 1a; RNA interference;insulin receptor substrate 1;High glucose and insulin; Myocardial hypertrophy

R322.57

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.008

2011-02-14

2011-04-17

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目資助(L2010684)

李延輝,男(1984年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)