陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

·論著·

二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育及成活率的影響

陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

目的應(yīng)用模式生物斑馬魚的胚胎發(fā)育技術(shù)，研究3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對魚類胚胎發(fā)育的毒性作用和成活率影響。方法受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設(shè)空白對照和甲醇溶劑對照各一個，3，3’-二甲基聯(lián)苯胺的毒性試驗(yàn)濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。斑馬魚受精卵收集后馬上進(jìn)行藥物暴露浸洗試驗(yàn)，每個磨口瓶內(nèi)放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2小時觀察一次，每次隨機(jī)抽取3枚受精卵，進(jìn)行拍照，并顯微觀察不同濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育過程的影響。結(jié)果4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發(fā)育早期或卵期就全部死亡，病死率達(dá)到100%;2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以引起半數(shù)斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的死亡，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育有一定的加速作用。結(jié)論高濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發(fā)育有嚴(yán)重的毒害和致死作用，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育可能有一定的加速作用。

3，3’-二甲基聯(lián)苯胺;斑馬魚;胚胎發(fā)育;成活率

聯(lián)苯胺類化合物屬于芳香胺類化學(xué)物質(zhì)，在樹脂、橡膠、染料等化工產(chǎn)業(yè)合成中有廣泛應(yīng)用。以及印染織物的漂洗等多種途徑進(jìn)入環(huán)境。由于首先在職業(yè)人群中發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)病率較高，故引起了科學(xué)家對聯(lián)苯胺類化學(xué)物質(zhì)的關(guān)注。陳紀(jì)綱通過連續(xù)18年的健康監(jiān)護(hù)，采用病例對照研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯胺的職業(yè)接觸人群中膀胱癌發(fā)病率超過1%，是膀胱癌的高危人群［1］。李健等［2］通過用3，3－二氯聯(lián)苯胺對 A 系小鼠經(jīng)口灌胃，發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致小鼠惡性腫瘤如肺癌、肝膽癌等發(fā)生率增高，研究表明這類化合物對哺乳動物具有直接或潛在的致癌作用，關(guān)于聯(lián)苯胺類化合物對水生生物的毒性研究也有一些報道［3］。近年來斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)以其特有的優(yōu)勢正逐步成為急性毒性試驗(yàn)的替代手段［4，5］，目前有關(guān) 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育影響還未見研究報道。本研究通過對斑馬魚胚胎的急性毒性試驗(yàn)，觀察胚胎發(fā)育期間二甲基聯(lián)苯胺暴露所導(dǎo)致魚卵形態(tài)及最終孵化率和成活率的變化，探索其敏感性指標(biāo)，以填補(bǔ)此類化合物對水生生物毒性數(shù)據(jù)研究的短缺，進(jìn)一步完善聯(lián)苯胺類化合物對水生生物的毒性研究資料，并可為環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)，也為致癌研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 二甲基聯(lián)苯胺(3，3’-二甲基聯(lián)苯胺)由石家莊市職業(yè)病防治院提供。分析純，性能穩(wěn)定，在水溶液內(nèi)基本不發(fā)生水解、氧化、光解等反應(yīng)，符合水生毒理學(xué)試驗(yàn)要求。

1.2 試驗(yàn)用魚及其受精卵的采集 斑馬魚為6個月齡以上，體長4 cm左右的紅色品種親魚。按照雌雄魚數(shù)量約為1∶1的比例放養(yǎng)在25 cm×25 cm×30 cm的玻璃水族箱中，控制溶氧0.6 mg/L以上，水溫(26±1)℃，pH 值 8～8.5，水硬度 28～32°dH，光暗比13 h∶11 h。每天喂2次經(jīng)紫外線消毒處理過的紅線蟲(水絲蚓)。在缸底鋪放一層卵石，以誘發(fā)親魚自然繁殖產(chǎn)卵受精。根據(jù)其間隔性產(chǎn)卵的特點(diǎn)而進(jìn)行不間斷的觀察，以便及時收集受精卵并轉(zhuǎn)移到預(yù)先配制好的蒸餾水內(nèi)。為盡量避免自來水中所含物質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果，受精卵和胚胎發(fā)育試驗(yàn)的用水，均為統(tǒng)一配制、充氧飽和、溫度恒定的蒸餾水。未受精卵在1～2 h內(nèi)會變?yōu)槿榘咨?，用吸管及時剔出。

1.3 儀器設(shè)備 (1)DMBA300-C數(shù)碼照相顯微鏡;(2)光照培養(yǎng)箱;(3)可控溫加熱器;(4)充氧泵;(5)水族箱等。

1.4 方法 按照OECD的要求設(shè)計胚胎毒性試驗(yàn)［6］，受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設(shè)空白對照和甲醇溶劑對照各1個，3，3’-二甲基聯(lián)苯胺的毒性試驗(yàn)濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。根據(jù)以往的研究，胚胎對芳香族化合物的吸收隨著暴露濃度的增大和時間延長胚胎體內(nèi)的化合物含量不斷增大直至死亡，而在胚胎發(fā)育早期更容易吸收。一般認(rèn)為，器官早期(原腸胚期前，受精后0～8 h)胚胎對致畸原最為敏感［7］。因此，受精卵收集后馬上進(jìn)行藥物暴露浸洗試驗(yàn)，每個磨口瓶內(nèi)放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2小時觀察1次，觀察、統(tǒng)計不同藥物濃度處理后在不同發(fā)育時間內(nèi)受精卵的發(fā)育過程、病死率和成活率等，每次隨機(jī)抽取3枚受精卵，進(jìn)行顯微觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育過程的影響 見表1。

表1 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺處理下斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的狀況

2.2 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育成活率的影響見表2。

表2 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺處理下斑馬魚胚胎發(fā)育的成活率

3 討論

根據(jù)靜態(tài)觀察標(biāo)準(zhǔn)，參照蔡翔等［8］的方法，把斑馬魚的早期胚胎發(fā)育過程分為3個時期:(1)單細(xì)胞期。受精卵外有較厚的透明膠膜，卵內(nèi)密布卵黃顆粒。受精后10 min動物極出現(xiàn)。(2)囊胚期。卵裂后期，胚盤卵裂球數(shù)漸增，卵裂球間的細(xì)胞界限漸變模糊，胚盤高矗于卵黃上，此即囊胚早期。到囊胚晚期，囊胚表面細(xì)胞向卵黃部分下包，胚盤變成弓狀。(3)原腸胚期。胚盤細(xì)胞下包至卵黃1/2處時，整個囊胚邊緣處形成略厚的胚環(huán)，其上層細(xì)胞為外胚層，下層細(xì)胞為內(nèi)胚層，胚環(huán)背側(cè)增厚形成胚盾。

表1可見，在2 h內(nèi)，由于暴露處理時間很短，各處理組的受精卵沒有明顯的變化，受精卵呈透明狀，能看到卵的動物極出現(xiàn)2或4個細(xì)胞的卵裂早期現(xiàn)象。蒸餾水對照組和甲醇溶劑(≤0.3%)對照組的受精卵在每個時間段內(nèi)基本都能夠正常的發(fā)育，依次經(jīng)歷囊胚期、原腸期、體腔的形成、體節(jié)分化、魚形期，至到孵化為仔魚。說明低于0.3%濃度的甲醇助劑，不會造成斑馬魚胚胎發(fā)育的異常。2.16 mg/L藥物處理組的受精卵也能按照上述發(fā)育歷程發(fā)育并孵化出仔魚，但是整個發(fā)育時間比對照組提前大約24 h，并且還有一些身體微小、頭大尾小的畸形個體出現(xiàn)。這和以往的研究有相似之處，劉紅玲等［8］提出低濃度的二甲基聯(lián)苯胺能促進(jìn)胚胎發(fā)育，而高濃二甲基聯(lián)苯胺則抑制胚胎發(fā)育。有關(guān)低濃度的二甲基聯(lián)苯胺為何能加速胚胎發(fā)育，導(dǎo)致畸形個體出現(xiàn)有待今后進(jìn)一步的研究。

4.32 mg/L藥物處理組的斑馬魚卵少數(shù)能夠發(fā)育為囊胚，但4 h后多數(shù)出現(xiàn)囊胚的變形，隨后就是卵黃的凝聚與胚胎死亡，8～12 h內(nèi)，胚胎全部死亡。6.48 mg/L以上藥物處理組的受精卵都不能發(fā)育為囊胚期，很早就表現(xiàn)出明顯的卵黃凝聚反應(yīng)而使受精卵快速死亡。這說明4.32 mg/L左右的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可能是斑馬魚受精卵和胚胎發(fā)育的致死的臨界濃度。死亡的受精卵或胚胎都表現(xiàn)出卵黃凝聚，這可能是高濃度的二甲基聯(lián)苯胺類物質(zhì)能夠引起蛋白質(zhì)的變性所導(dǎo)致的。以往的研究認(rèn)為，在受精后0～8 h，原腸胚之前這段時間內(nèi)，胚胎被暴露在高濃度的有毒化合物中，可能會導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變或蛋白質(zhì)的凝聚反應(yīng)，這種損傷是不可修復(fù)的［9］。

由表2可見，蒸餾水對照和甲醇溶劑對照處理下，斑馬魚受精卵胚胎發(fā)育的成活率分別達(dá)到了96.8%和96.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。進(jìn)一步說明了低于0.3%的甲醇溶劑對魚卵發(fā)育沒有明顯影響，可以作為有機(jī)物水環(huán)境染毒實(shí)驗(yàn)的安全助溶劑。

4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發(fā)育早期或卵期就全部死亡，病死率達(dá)到100%，說明高濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對魚卵及其胚胎毒性作用很強(qiáng)。2.16 mg/L的二甲基聯(lián)苯胺暴露處理后，有約1/2的胚胎死亡或致畸而死，還有約1/2的受精卵(46.8%)能夠發(fā)育并孵化為仔魚，基本說明該濃度可能是影響斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的臨界濃度。2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以作為影響水生生物生存的一個限定指標(biāo)。(1)低于0.3%(體積分?jǐn)?shù))濃度的甲醇溶液，對斑馬魚的受精卵和胚胎發(fā)育無明顯影響，可作為有機(jī)物水環(huán)境染毒實(shí)驗(yàn)的安全助溶劑。(2)高濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發(fā)育有嚴(yán)重的毒害和致死作用，4.32 mg/L左右可以使是斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育全部致死，因此該濃度可能是一個致死臨界濃度。(3)2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以引起半數(shù)斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的死亡，可以作為影響和評價水生生物生存的一個限定性毒理指標(biāo)。(4)除了致死和致畸作用外，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育可能有一定的加速作用，有待今后進(jìn)一步研究。

1 陳紀(jì)剛.上海市聯(lián)苯胺接觸人群職業(yè)性膀胱癌的醫(yī)學(xué)監(jiān)護(hù).中國腫瘤，2001，10:206-209.

2 李健，黃超，竇桂榮.3，3-二氯聯(lián)苯胺經(jīng)口誘發(fā)A系小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的觀察.癌變·畸變·突變，2003，15:81-84.

3 Schulte C，Nagel R.Test acute toxicity in the embryo of zebrafish，Brachydanio rerio，as an alternative to the acute fish test:Preliminary results.ATLA，1994，22:12-19.

4 朱琳，史淑潔.斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評價中的應(yīng)用.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2002，13:252-254.

5 端正花，張斌田，朱琳.雙酚A對斑馬魚胚胎發(fā)育各階段的毒性及生物蓄積.中國環(huán)境科學(xué)，2008，28:260-263.

6 OECD.Guideline for testing of chemicals:Fish，embryo toxicity test with the zebrafish(Brerio).OECD，1996，62-76.

7 劉紅玲，于紅霞.聯(lián)苯胺類化合物對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究.生態(tài)毒理學(xué)報，2007，2:94-99.

8 蔡翔，王捷，王穎.應(yīng)用胚胎檢測技術(shù)評價氟嗎啉對斑馬魚胚胎—幼體發(fā)育的影響.農(nóng)藥，2005，44:271-273.

R 321-33

A

1002－7386(2011)17－2610－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.17.021

項目來源:河北省科技支撐計劃項目(編號:072761891)

050031 河北省石家莊市職業(yè)病防治院(陳文利、楊麗莉、高麗蕙);河北省自然科學(xué)基金委員會(趙梅);河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣站(王合全);河北師范大學(xué)(王建佳、高翔、陳昌生)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)及指標(biāo) 試驗(yàn)過程中，受精卵的死亡按照發(fā)育過程中卵黃出現(xiàn)凝集為準(zhǔn);胚胎死亡按照沒有身體運(yùn)動、沒有心動、身體變渾不透明為準(zhǔn)。成活率以仔魚從胚胎孵化出來之后的成活個體計算。成活率為每百粒卵能發(fā)育到48 h并孵化為仔魚的卵數(shù)。

2011－03－15)