鄭聲琴 何 杰 鄭 勤 張全安

結(jié)腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生具有多階段、多因素的特征，在此過程中涉及癌基因的突變和活化、抑癌基因的丟失或表達失調(diào)以及凋亡調(diào)節(jié)機制紊亂等遺傳學(xué)改變[1，2]。再生基因 Ⅳ (regenerating gene Ⅳ,Reg Ⅳ) 是新發(fā)現(xiàn)的1個癌基因，其有可能參與腫瘤尤其是消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。基因表達的序列分析 (serial analysis of gene expressi on,SAGE) 結(jié)果得到： Reg Ⅳ在結(jié)腸正常黏膜、結(jié)腸腺癌、 胰腺癌、 胃癌和前列腺癌中均表達，尤其在結(jié)直腸腺瘤癌變區(qū)其轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)特別明顯，但是在結(jié)腸正常黏膜 Reg Ⅳ 基因呈低表達[3]。通過 SAGE表達譜分析認為，Reg Ⅳ基因可能是消化系統(tǒng)癌微轉(zhuǎn)移的特異性標記物[4]，其表達上調(diào)可能與預(yù)后不良有關(guān)。我們采用免疫組織化學(xué)法,檢測Reg Ⅳ蛋白在結(jié)腸癌中的表達情況，旨在探討Reg Ⅳ在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取我院病理科 2008年～2010 年收集的102例結(jié)腸癌石蠟標本 (均取自腫瘤原發(fā)灶，均經(jīng)病理檢查確診)。其中男性 70例，女性32例，年齡 31～75 (51± 30) 歲，術(shù)前均未行放療和化療。50例正常結(jié)腸黏膜組織術(shù)中取出經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成石蠟標本。免疫 Reg Ⅳ蛋白多克隆抗體為Santa cruz產(chǎn)品，稀釋度為 1∶200； SABC免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京天根有限公司。

1.2 方法

結(jié)腸癌標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片 (厚度 4 pm)，其中一片用于常規(guī)HE 染色，其余用于免疫組織化學(xué)。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后入PBS (pH7.4)，經(jīng)甲醇- H2O2，室溫孵育20 min，除去內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗3遍；微波修復(fù)抗原，滴加抗原修復(fù)液室溫 10 min，甩去血清后滴加1 ∶200 Reg Ⅳ多抗，4℃ 過夜，0.5 mol/L PBS洗2 min 3 次；滴加生物素化羊抗兔IgG， 37℃、20 min，O- SM PBS 洗 5 min 4 次；經(jīng)DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。正常結(jié)腸組織對照用PBS代替一抗。

1.3 觀察指標

采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察，胞質(zhì)或胞膜呈棕色、棕褐色者為陽性細胞。顯微鏡下觀察 Reg Ⅳ表達強度， 標準為：0～5個腫瘤細胞染色記為0分；6 ～20個腫瘤細胞染色為1分；21～50個腫瘤細胞染色為2分；50個以上腫瘤細胞染色為3分。0分為陰性， 1～3 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Reg Ⅳ在結(jié)腸癌組織中的表達

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，50例正常結(jié)腸黏膜上皮中無Reg Ⅳ 表達，而102例結(jié)腸癌組織中35例 (34.31%) 呈陽性表達，兩組比較差異有顯著性 (P<0.05)。

2.2 Reg Ⅳ表達與結(jié)腸癌病理分級和臨床分期的關(guān)系

G1級結(jié)腸癌組織與G3級比較，Reg Ⅳ陽性表達率明顯增高，差異有顯著性，P<0.05。T0～T4期結(jié)腸癌組織中Reg Ⅳ陽性率分別為0、33.33%、44.44%、52.38%和71.42%，差異均有顯著性(P<0.05)；與T0期比較，T4期染色體分值明顯增加，P<0.05，見表1。對Reg Ⅳ表達陽性率與結(jié)腸癌臨床分期做回歸分析，見圖1，回歸方程為 γ=5.955+15.83X，為直線回歸，相關(guān)系數(shù) γ=0.973，表明 Reg Ⅳ表達強度與結(jié)腸癌臨床分期呈線性關(guān)系。

3 討論

Reg家族是一群主要在肝、胰和胃腸道中發(fā)揮作用的小分子、多功能的分泌性蛋白,與組織損傷、炎癥、糖尿病和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。2001年Hartupee等[5]從炎癥性腸病庫中篩選出再生基因4 (regenerating islet-derived family,member 4,RegⅣ)，其定位于1p12-13.1，RegⅣ蛋白由158個氨基酸組成。 RegⅣ選擇性表達于正常胰腺和胃腸道上皮,炎癥或腫瘤組織中其表達明顯增強， 提示RegⅣ與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能關(guān)系密切。

表1 Reg Ⅳ表達與結(jié)腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系(例)

注： ①為與 G1相比，P<0.05；②為與T0相比，P<0.05；③為與T1相比，P<0.05

圖1 Reg Ⅳ表達與結(jié)腸癌臨床分期的相關(guān)性

Oue 等[6]發(fā)現(xiàn)雖然RegⅣ在結(jié)直腸癌 (colorectal cancer，CRC) 的表達比正常結(jié)腸組織高。36.1% (13/36) 結(jié)腸直腸腺癌是RegⅣ陽性，并與腫瘤分期有關(guān)。93.3% (14/15) 結(jié)腸直腸類癌瘤檢測到RegⅣ表達。有學(xué)者[7]應(yīng)用RT-QPCR和膜芯片技術(shù)，研究CRC患者外周血中RegⅣ等6種mRNA標志物的表達，發(fā)現(xiàn)RegⅣ mRNA過表達率為80.0% (64/80)，RegⅣ mRNA過表達與CRC TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。CRC伴肝轉(zhuǎn)移者RegⅣ表達陽性率明顯高于無轉(zhuǎn)移病例。 RegⅣ陽性表達CRC比陰性表達存活率低 。ELISA法檢測CRC患者術(shù)前血清RegⅣ水平顯示Ⅳ期CRC伴肝轉(zhuǎn)移患者較0～Ⅲ期患者明顯升高，說明RegⅣ是預(yù)后不良的預(yù)測因子,血清RegⅣ濃度可能預(yù)測CRC并發(fā)肝轉(zhuǎn)移。Violette 等[8]應(yīng)用差異展示PCR法，分析發(fā)現(xiàn)RegⅣ在CRC耐藥細胞中高表達,在敏感細胞系則是低表達,提示RegⅣ在CRC中的潛在作用,而且可能是影響腫瘤患者存活率的預(yù)后指標并與腫瘤的耐藥性有關(guān)。

Oue 等[7]發(fā)現(xiàn)29.4%的胃癌RegⅣ呈陽性表達,并與小腸黏蛋白表型和神經(jīng)內(nèi)分泌分化有關(guān)。定量RT-PCR分析顯示RegⅣ在30.4%的胃癌組織中呈高水平表達，而在正常胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰腺都呈低水平表達。Sentani 等[9]對多種組織印戒細胞癌 (signet-ring cell carcinoma,SRCC) 進行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)RegⅣ染色有助于胃腸道SRCC的診斷。Takehara 等[10]報道RegⅣ在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)細胞中過表達。 RegⅣ蛋白呈時間劑量依賴性促進PDAC細胞的生長，通過RNA干擾技術(shù)可阻斷RegⅣ的促生長效應(yīng),同時外源性RegⅣ蛋白促進PK-45P細胞的Akt的磷酸化， 提示RegⅣ的促生長效應(yīng)可能通過PKB/Akt信號通路來介導(dǎo)， 以抗體中和RegⅣ效應(yīng)可能是一潛在的治療PDAC的工具。早期PDAC患者血清中呈現(xiàn)RegⅣ水平的顯著提高， 血清RegⅣ可能是檢測早期PDAC的腫瘤標志物。然而， RegⅣ在CRC、 GC、炎癥性腸病、闌尾黏液囊腺瘤和腹膜假性黏液瘤 (pseudomyxoma peritonei,PMP)、前列腺癌和唾液腺囊性腺樣癌中高表達,所以血清中RegⅣ水平的升高在診斷中的靈敏度和特異度還要大量基礎(chǔ)研究的證實。本實驗結(jié)果顯示：Reg Ⅳ在結(jié)腸癌中的表達明顯高于正常結(jié)腸組織 ；在結(jié)腸癌細胞中 G1、G2和G3級表達分別為 0 、22.22%和68.66%，與G1相比，G3級染色分值明顯增加，兩者間比較，差異有顯著性。結(jié)果表明，Reg Ⅳ與結(jié)腸癌分化密切相關(guān)，分化程度越低，其表達越高，提示Reg Ⅳ有可能是結(jié)腸癌病理分級診斷的輔助指標，通過研究兩者相關(guān)性我們發(fā)現(xiàn)兩者呈線性關(guān)系，這也表明Reg Ⅳ表達水平隨結(jié)腸癌侵襲力增強而增高。Reg Ⅳ有望作為1種有價值的生物標志物來評估結(jié)腸癌的惡性程度，對治療方案的選擇和術(shù)后隨訪提供指導(dǎo)，提示Reg Ⅳ與結(jié)腸癌的發(fā)生及演變過程密切相關(guān)，對結(jié)腸癌行Reg Ⅳ蛋白的檢測有可能作為臨床判斷結(jié)腸癌生物學(xué)行為浸潤深度的一項重要指標，但其作用機制還有待進一步探討。谷化平等[11]研究認為VEGF、EGFR和PTEN與結(jié)腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的指標，而VEGF和EGFR是目前臨床應(yīng)用較廣的檢測指標，Reg Ⅳ的作用是否與VEGF、EGFR相關(guān)，可能是我們下一步研究的內(nèi)容之一。

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