方月琴，郭娟寧，孫曉明，侯一平，顧 準(zhǔn)

(1.江蘇健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江蘇蘇州215411;2.新加坡國家心臟中心研發(fā)部門，新加坡168752;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河南新鄉(xiāng)453003;4.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041)

高效制備人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞

方月琴1，2，郭娟寧3，孫曉明2，侯一平4，顧 準(zhǔn)1*

(1.江蘇健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江蘇蘇州215411;2.新加坡國家心臟中心研發(fā)部門，新加坡168752;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河南新鄉(xiāng)453003;4.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041)

目的 提高人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSC)轉(zhuǎn)化效率，縮短其產(chǎn)生周期，并避免引入異源基因。方法 利用GP2-293反轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)對(duì)人包皮成纖維細(xì)胞(HFFs)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，引入小分子物質(zhì)，并對(duì)類胚胎干細(xì)胞(ESC)克隆進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)，檢測(cè)標(biāo)記蛋白，定向誘導(dǎo)分化能力和核型分析。結(jié)果 HFFs經(jīng)轉(zhuǎn)化后，20 d出現(xiàn)形態(tài)與ESC克隆相似的hiPSC，比經(jīng)典法縮短了10 d，效率提高約12倍。它們與ESC同樣表達(dá)標(biāo)記蛋白;體外成功定向分化為心肌細(xì)胞。核型分析表明該hiPSC染色體核型正常。結(jié)論 建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化效率高、周期短的hiPSC生成體系，并成功誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞，為心血管疾病的模型構(gòu)建和臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞;轉(zhuǎn)化效率;形成周期;心肌細(xì)胞;分化

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是體細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化因子重編程得到的、與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)具有相似的形態(tài)、功能特性的多能干細(xì)胞［1－2］，是疾病模型研究的良好載體，并為臨床進(jìn)行自體干細(xì)胞移植提供選擇［3］。本實(shí)驗(yàn)采用 GP2-293細(xì)胞包裝OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種因子的反轉(zhuǎn)錄病毒感染體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化過程中加入 SB431542、PD0325901和Thiazovivin 3種小分子物質(zhì)，以建立快速、高效iPSC誘導(dǎo)方法，并探討其在體外定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的潛能，為構(gòu)建心血管疾病模型以及自體干細(xì)胞臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HFFs(新生兒包皮來源)(ATCC公司);GP2-293細(xì)胞(Clontech公司);小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF(Chemicon公司);所有細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen公司)。上述細(xì)胞培養(yǎng)基成分為DMEM中含10%胎牛血清和1×L-谷氨酰胺。聚凝胺和絲裂霉素C(Sigma公司)，qRT-PCR試劑盒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Clontech公司)，SB431542、PD0325901和 Thiazovivin(Stemgent公司)。

人胚胎干細(xì)胞hESC9(WiCell)，培養(yǎng)基為hESC培養(yǎng)液(DMEM:F12，20%KOSR，1×非必需氨基酸，1 × L-谷氨酰胺，0.11 mol/L 2-巰基乙醇，10 μg/L重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF)。

1.2 質(zhì)粒

質(zhì) 粒 pMXs-OCT4、pMXs-SOX2、pMXs-KLF4、pMXs-C-MYC(Addgene公司);pMXs-GFP的準(zhǔn)備:以eGFP質(zhì)粒(新加坡科學(xué)研究院試驗(yàn)性治療中心Dr.William Sun實(shí)驗(yàn)室提供)為PCR模板，設(shè)計(jì)引物eGFP前引物:5'-CGGGAATTCGCCCTTCACCATGGT GAGCAAGGGCGAGGA-3';eGFP后引物:5'-CCGG AATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'，引物兩端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn);PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶進(jìn)行酶切;同時(shí)用該酶切除pMXs-OCT4中OCT4基因以獲得pMXs空載體，再將兩者進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。經(jīng)酶切鑒定片段插入、測(cè)序明確序列及方向后，得到pMXs-GFP。大量抽提質(zhì)粒于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human induced pluri-potent stem cells，hiPSC)生成過程

先準(zhǔn)備OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種轉(zhuǎn)化因子的反轉(zhuǎn)錄病毒。在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1×106個(gè) GP2-293細(xì)胞，第 2天觀察細(xì)胞，到達(dá)70%～80%匯合時(shí)利用磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，次日早上換液。同時(shí)在 6孔板上培養(yǎng)105/孔人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)(0 d)。轉(zhuǎn)染48 h后收集GP2-293細(xì)胞上清液，經(jīng)0.45 μm過濾器進(jìn)行過濾，留200 μL作病毒滴度檢測(cè)(反轉(zhuǎn)錄病毒qRT-PCR滴度檢測(cè)試劑盒);混合4種病毒液，加入終濃度為8 μg/L的聚凝胺。在培養(yǎng)HFFs的6孔板每孔加入8 mL病毒混合液，感染8 h后吸去病毒液，換成2 mL新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)液(1 d)。GP2-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后再次收集病毒，對(duì)HFFs進(jìn)行2次感染，8 h后換成4 mL 10% 胎牛血清培養(yǎng)基(2 d)。5 d時(shí)對(duì)HFFs進(jìn)行換液;同時(shí)先在6 cm培養(yǎng)皿加2 mL明膠，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱放置半小時(shí)以上，吸去明膠后，加絲裂霉素C處理過的飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF，106/6 cm培養(yǎng)皿。6 d將病毒感染的HFFs經(jīng)胰蛋白酶消化后轉(zhuǎn)移到5 d準(zhǔn)備的MEF上，105/6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。第2天將 MEF培養(yǎng)液換成 hESC培養(yǎng)液，其中含10 μg/L的 bFGF 和濃度分別為2 μmol/L SB431542、0.5 μmol/L PD0325901 和 0.5 μmol/L Thiazovivin的3種小分子物質(zhì)。隔天換1次培養(yǎng)液直至13 d出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)后，換成不含小分子物質(zhì)的hESC培養(yǎng)液，直至克隆足夠大。21 d左右將形狀類似hESC的克隆，用針頭切下來后培養(yǎng)到鋪有MEF的器官培養(yǎng)皿(organ culture dish，OCD)上，1個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至1個(gè)OCD，分別標(biāo)記。待克隆長(zhǎng)大后再進(jìn)行傳代，同傳統(tǒng)hESC培養(yǎng)。

1.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色和免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色

利用ALP測(cè)定試劑盒(Vector Laboratories公司)，根據(jù)說明書對(duì)iPSC和hESC克隆進(jìn)行ALP染色。免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色操作:細(xì)胞在4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌2次，5%胎牛血清和0.1%Triton X-100室溫封閉15 min，之后加入一抗，4℃孵育過夜。一抗有抗OCT4(1∶50，Abcam公司)，SSEA4(1∶500，Chemicon 公 司)，TRA-1-81(1∶100，Santa Cruz公司)和 TRA-1-60(1∶100，Santa Cruz公司)。之后PBS清洗2次，加入二抗室溫孵育1 h。二抗為 Alexa flour 555-標(biāo)記抗小鼠 IgG(1∶1 000，Invitrogen 公司)。胞核染色是 DAPI(1∶1 000，Invitrogen 公司)。

1.5 擬胚體(embryonic body，EB)形成與誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞

將iPS克隆在10 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至85%～90%匯合，轉(zhuǎn)移至6孔低黏附板上進(jìn)行擬胚體(EB)形成。培養(yǎng)液為EB20培養(yǎng)液(DMEM:F12中含20% 胎牛血清，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巰基乙醇)。一般2個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中85%～90%匯合的iPSC可以轉(zhuǎn)移至一個(gè)6孔板上。37℃培養(yǎng)過夜后，將EB20培養(yǎng)液換成CARM心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM中含1×ST混合液，1×非必需氨基酸，1×L-谷氨酰胺，0.11 mmol/L 2-巰基乙醇)，1～2周內(nèi)出現(xiàn)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞團(tuán)。

將搏動(dòng)的心肌細(xì)胞團(tuán)從6孔板中小心取出，培養(yǎng)于經(jīng)明膠處理過的多電極陣列(multi-electrode array，MEA)中央，待其附著固定后，用MEA信號(hào)記錄儀對(duì)心肌細(xì)胞生理信號(hào)進(jìn)行記錄。

1.6 染色體核型分析

將待分析的iPSC細(xì)胞系R1.9、R1.15和hESC培養(yǎng)于鋪有MEF的6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，待50% ～90%匯合時(shí)，交由新加坡KK醫(yī)院產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)室分析。

2 結(jié)果

2.1 pMXs-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建

pMXs-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入GP2-293細(xì)胞后，熒光倒置顯微鏡下觀察顯綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率在80%左右。

經(jīng)pMXs-GFP病毒感染的人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblast cells，HFFs)，感染病毒3 d后熒光下可見80%以上HFFs都攜帶GFP。

2.2 反轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定

按照反轉(zhuǎn)錄病毒qRT-PCR滴度檢測(cè)試劑盒操作說明，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析R2=0.9991。根據(jù)所得方程式計(jì)算4種病毒量，發(fā)現(xiàn)每種病毒滴度接近，約為2×109copies/mL。在進(jìn)行感染時(shí)，6孔板中每種病毒加入相同的量，為2 mL/孔。

2.3 從HFFs制備hiPSC

iPSC制備過程和時(shí)間表如圖1A所示。一個(gè)6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)1×105病毒感染HFFs，21 d時(shí)約出現(xiàn)30個(gè)左右類似hESC的克隆，效率比經(jīng)典方法高12倍。同時(shí)，iPSC形成周期從30 d縮短到20 d，節(jié)約了工作時(shí)間。

在MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞上，iPSC與hESC克隆形態(tài)形態(tài)相似(圖1B)，呈圓形或橢圓形，與MEF之間有明顯而清晰的邊界，克隆內(nèi)細(xì)胞排列有序而緊密。一般7 d傳代。

2.4 ALP與免疫熒光染色結(jié)果

除ALP之外，其他干細(xì)胞特征性標(biāo)志也做了檢測(cè)。由圖2可知R1.9與hESC同樣都表達(dá)了這些干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白質(zhì)。

2.5 hiPCS和hESC體外誘導(dǎo)分化成的心肌細(xì)胞

iPSC和hESC首先懸浮培養(yǎng)成球形EB，然后經(jīng)過2周左右誘導(dǎo)分化，形成具有節(jié)律性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞團(tuán)塊，形態(tài)如圖2A所示。將心肌細(xì)胞團(tuán)置于MEA上記錄心肌電生理情況 (圖2B)，從hESC分化得到的心肌細(xì)胞兩次搏動(dòng)之間間隔為826 ms，幅度為119 μV，心率為73次/min;從hiPS穩(wěn)定細(xì)胞系R1.19分化得到的心肌細(xì)胞兩次搏動(dòng)之間間隔為820 ms，幅度為117 μV，心率為70次/min。

2.6 核型分析結(jié)果

hESC購自美國威斯康星國際干細(xì)胞庫，核型為46，XX;iPSC 來源細(xì)胞是 HFFs，核型為 46，XY。新加坡KK婦女與兒童醫(yī)院產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果均為正常核型，并與預(yù)期相符。

3 討論

體細(xì)胞經(jīng)4種轉(zhuǎn)錄因子作用可轉(zhuǎn)變?yōu)閕PSC，它們不但擁有正常核型，還具有與ESC相似的細(xì)胞表面標(biāo)記及向3個(gè)胚層細(xì)胞發(fā)育的潛能［1］，從而在一定程度上規(guī)避了hESC運(yùn)用所引起的倫理學(xué)問題［2］。近年來全球掀起了iPS研究高潮，從iPS產(chǎn)生機(jī)制和疾病相關(guān)iPS方面展開了廣泛而深刻的研究，以期早日為臨床醫(yī)學(xué)服務(wù)［4－5］。

圖1 iPSC的制備過程和iPSC與hESC克隆標(biāo)記物鑒定Fig 1 Induction process for iPSC and specific markers detection

iPSC最早是利用PLAT-E細(xì)胞制備反轉(zhuǎn)錄病毒，向成體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC4種轉(zhuǎn)化因子獲得［6］。但hiPSC轉(zhuǎn)化效率低(10個(gè)iPS克隆/5×104HFFs)，所需周期長(zhǎng)(30 d)，亟需提高轉(zhuǎn)化效率并縮短實(shí)驗(yàn)周期。研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過程中加入3種小分子化合物SB431542、PD0325901和Thiazovivin可大幅提高轉(zhuǎn)化效率，并縮短重編程周期［7］。但是該過程需先將鼠Slc7a受體通過慢病毒轉(zhuǎn)入HFFs，再用4種轉(zhuǎn)錄因子的反轉(zhuǎn)錄病毒，對(duì)攜帶Slc7a受體的HFFs進(jìn)行轉(zhuǎn)化。該過程需兩步感染，雖提高了iPSC的轉(zhuǎn)化效率，但同時(shí)引入了異源基因鼠Slc7a受體。

圖2 hiPSC和hESC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞Fig 2 Cardiomyocytes from hESC and iPSC

本研究通過GP2-293細(xì)胞包裝4種轉(zhuǎn)化因子。GP2-293體系包裝所得病毒能夠直接感染人分裂期細(xì)胞，無需在人體細(xì)胞中導(dǎo)入鼠源基因Slc7a受體，也省略了慢病毒包裝與感染過程。故可避免在目的細(xì)胞中引入異源基因，并在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。

在HFFs向iPSC轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞形態(tài)、極性、細(xì)胞與細(xì)胞間關(guān)系都發(fā)生了巨大變化。此過程中，細(xì)胞開始表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白，由此推測(cè)能夠促進(jìn)間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化的因子可促進(jìn)iPSC的生成，如TGFβ通道拮抗劑SB431542。此外，MEK通路是體細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程所必需的，而非ESC所需。研究也表明抑制MEK-ERK通路對(duì)于iPSC產(chǎn)生過程也有很重要的促進(jìn)作用，而PD0325901為MEK抑制劑［8］。Thiazovivin是促細(xì)胞存活分子，以上3種物質(zhì)合用能夠提高轉(zhuǎn)化效率，縮短 iPSC形成周期［7］。因此在本實(shí)驗(yàn)中也引入了這3種物質(zhì)，提高了轉(zhuǎn)化效率。

本研究建立了一種安全有效的iPSC制備方法，并體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。最近報(bào)道用較少的因子［9］即可獲得轉(zhuǎn)化，或是將體細(xì)胞直接誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞［10］或神經(jīng)細(xì)胞［1］，避開轉(zhuǎn)化過程，為疾病模型構(gòu)建和自體細(xì)胞治療節(jié)約了時(shí)間。本研究將繼續(xù)探討用更優(yōu)化的方法進(jìn)行心血管疾病特異性iPS細(xì)胞系構(gòu)建及自體細(xì)胞治療的嘗試。

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［2］林真，沈曉麗．轉(zhuǎn)導(dǎo)特定基因編程體細(xì)胞為多能干細(xì)胞［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30:206－208．

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Induction of human fibroblast cells to pluripotent stem cells and differentiation into cardiomyocytes

FANG Yue-qin1，2，GUO Juan-ning3，SUN Xiao-ming2，HOU Yi-ping4，GU Zhun1*

(1.Dept．of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411;2.Research and Development Unit，National Heart Center，168752 Singapore;3.Dept．of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003;4.Sichuan University，Chengdu 610041，China)

ObjectiveTo increase the transduction efficiency of hiPSC formation，decrease the time schedule and avoid the possibility of exogene introduction．MethodsHuman fibroblast cells were infected by retrovirus with four factors．During transduction，small molecules were added into hESC medium，until iPSC colonies grew big enough to be transferred．The stable iPSC colonies were detected by the expression of ESC protein markers，cardiomyocytes differentiation and karotyping analysis．ResultsThe reprogramming period was shortened by 10 days with 12 times higher efficiency．The iPSC shared similar protein expression level with hESC．Both iPSC and hESC were differentiated into cardiomyocytes successfully with similar MEA data and both showed normal karotyping results．ConclusionsThe established iPSC reprogramming system is efficient and time-saving for providing research model for cardiovascular disease modeling and clinical study．

induced pluripotent stem cells;transduction efficiency;time schedule;cardiomyocytes;differentiation

R 318.11

A

1001-6325(2012)09-1030-06

2011－06－13

2011－12－30

國家自然科學(xué)基金(81072510);河南省教育廳課題(2008A340001)

*通信作者(corresponding author):yueqinfang@yahoo．com．cn

志謝:感謝新加坡科學(xué)研究院試驗(yàn)性治療中心William Sun博士提供eGFP質(zhì)粒。