楊 煉，王婭蘭，盛永濤，熊 薇，徐劍俠，唐 怡，李 嫻

(重慶醫(yī)科大學病理教研室，重慶400016)

大腸癌ART1的表達與VEGF、整合素αVβ3表達及微血管形成的相關(guān)性

楊 煉，王婭蘭*，盛永濤，熊 薇，徐劍俠，唐 怡，李 嫻

(重慶醫(yī)科大學病理教研室，重慶400016)

目的 探討大腸癌組織中單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶ART1的表達與VEGF、整合素αVβ3表達的相關(guān)性及其對大腸癌組織微血管生成的影響。方法 免疫組化檢測大腸癌組織中ART1、VEGF及整合素αVβ3的表達;免疫熒光雙標檢測ART1/VEGF及ART1/整合素αVβ3的共表達，用Chalkley分析法評估微血管的形成。結(jié)果 ART1、VEGF與整合素αVβ3的表達高于對照(P＜0.05)，且ART1與VEGF、整合素αVβ3的表達呈正相關(guān)(P＜0.05)。ART1/VEGF及ART1/整合素αVβ3共表達的大腸癌組織微血管密度較高(分別為25.4±8.23和22.3±5.9)，且高于非共表達組(分別為5.5±2.0和8.1±3.3，P＜0.01)。結(jié)論 ART1在大腸癌組織中表達增強，并與VEGF及整合素αVβ3的表達具有正相關(guān)性，可能促進腫瘤微血管生成。

ART1;VEGF;整合素αVβ3;大腸癌;微血管形成

單 ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶［mono(ADP-ribosyl)transferase，ARTs］催化單ADP核糖基化反應(yīng)(mono-ADP-ribosylation)，將ADP-核糖從 NAD+轉(zhuǎn)移到受體蛋白質(zhì)氨基酸殘基上，對細胞多種蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，影響細胞分化和增殖過程。有研究者發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌可激活A(yù)RTs，誘發(fā)ADP核糖基轉(zhuǎn)移并改變黏膜蛋白結(jié)構(gòu)，與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［1］。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)5種 ARTs(ART1～ART5)。ART1存在于人類的骨骼肌細胞、心肌細胞、白細胞及氣道上皮細胞中［2－3］。ART1可以修飾成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)，改變FGF-2與細胞表面受體結(jié)合的親和性從而影響FGF-2信號傳導(dǎo)過程［4］。但ART1與腫瘤關(guān)系的研究還很少。ART1能否通過調(diào)節(jié)VEGF和整合素αVβ3的表達影響大腸癌血管生成是本研究的重點，并為進一步研究ART1調(diào)節(jié)腫瘤侵襲機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸癌標本來自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2005年－2010年間經(jīng)明確診斷病例80例。病理學分級嚴格按照WTO大腸癌分級標準。其中高分化腺癌(Ⅰ級)20例、中分化腺癌(Ⅱ級)24例、低分化腺癌及黏液腺癌(Ⅲ級)36例。另20例正常腸黏膜作對照。所有標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2 試劑

羊抗人 ART1(S-15，SC-20255)多克隆抗體(Santa Cruz公司)，羊抗小鼠VEGF多克隆抗體(北京中衫金橋公司)，羊抗小鼠整合素αVβ3、兔抗人CD34多克隆抗體、熒光素Cy3標記兔抗羊IgG、熒光素FITc分別標記的羊抗小鼠及羊抗兔IgG(北京博奧森公司)。免疫組化試劑盒(EnVisionTMDetection Kit)(基因科技上海公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化:按照EnVisionTMDetection Kit免疫組化試劑盒說明書操作。結(jié)果判定參照文獻［5］進行。陽性范圍:隨機觀察5～10個中倍視野(×200倍)，將每個視野中陽性細胞數(shù)的平均百分比作為該切片的陽性細胞百分比率。判別標準:陽性百分比＜5%為0分，介于5% ～25%之間判為1分，26% ～50%之間為2分，＞50%為3分。染色強度:無著色為0分，黃色為1分，(深)棕黃色為2分，棕褐色為3分;上述兩項結(jié)果相加，0分為陰性(－)，1～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等度陽性(2+)，6分為強陽性(3+)。另以PBS代替一抗為陰性對照，已知陽性小鼠大腦圖片為陽性對照。

1.3.2 免疫熒光雙標染色:按常規(guī)免疫熒光雙標染色法，對同一切片組織ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3的共表達進行檢測。FITc標記的熒光抗體在525 nm光波激發(fā)下呈現(xiàn)綠色熒光;Cy3標記的熒光抗體在570 nm光波激發(fā)下呈現(xiàn)紅色熒光。用Emage-Pro Express軟件進行圖像疊加處理同一切片組織在2種光波下的呈色。PBS分別代替一抗、熒光抗體作為陰性對照，已知陽性小鼠腦組織切片為陽性對照。

1.3.3 腫瘤微血管密度(MVD):按照文獻［6］的評判標準，用Chalkley分析法計數(shù)腫瘤內(nèi)著色的毛細血管和微小血管數(shù)量。棕色單個內(nèi)皮細胞或者實心內(nèi)皮細胞團均作為一個血管計數(shù)。腫瘤內(nèi)纖維增生區(qū)、壞死區(qū)及與腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管不計數(shù)。腫瘤間質(zhì)中的厚壁血管及管腔直徑超過8個紅細胞直徑之和的較大血管也排除在外。計數(shù)方法:每張染色切片選擇3～5個血管數(shù)量最多的癌間質(zhì)區(qū)，在高倍視野(×400倍)下進行血管計數(shù)。每例標本分別計數(shù)3～5個視野，取每個視野血管數(shù)量的平均值.

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSSl2.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗、Wilcoxon秩和檢驗及Speaman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

ART1、VEGF、整合素 αVβ3染色均位于腫瘤細胞胞質(zhì)及胞膜 (圖 1)，80例大腸癌中，ART1、VEGF、整合素 αVβ3陽性表達率分別為 67.5%(54/80例)、85%(68/80 例)、70%(56/80 例)。陽性率及表達強度均明顯高于正常腸黏膜組織(P＜0.05)(表1)。

圖1 ART1、VEGF及整合素αVβ3在大腸癌組織中的表達Fig 1 The expression of ART1，VEGF and integrin αVβ3 in colorectal carcinoma by immunohistochemical staining(×200)

表1 ART1、VEGF和整合素αVβ3在大腸癌及對照腸黏膜中的表達Table 1 The expression of ART1，VEGF and integrin αVβ3 in colorectal carcinoma and control colon mucosa

從臨床資料上看，ART1、VEGF、整合素 αVβ3的表達在患者年齡、性別及病理學分級等方面未見明顯差別。同時，腫瘤漿膜浸潤和(或)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組與無漿膜浸潤和(或)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間，ART1的表達陽性率統(tǒng)計顯示差別不明顯，但是VEGF和整合素αVβ3的表達在腫瘤漿膜浸潤和(或)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組中的表達陽性率明顯增高(P＜0.05)(表2)。

2.2 免疫熒光雙標染色結(jié)果

ART1為Cy3標記顯示紅色熒光，顯色部位位于腫瘤細胞胞質(zhì)及胞膜;VEGF和整合素αVβ3為FITc標記顯示綠色熒光，顯色部位均位于腫瘤細胞胞質(zhì);ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3共表達經(jīng)激光共聚焦顯示橙色熒光(圖2)。80例大腸癌組織中 ART1、VEGF、整合素 αVβ3 表達率分別為72.5%(58/80)、85%(68/80)、72.5%(58/80)。其中ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3共表達分別為51例、40例，同時陰性表達分別為5例、10例。Spearman相關(guān)性分析顯示兩者表達呈正相關(guān)(P＜0.05)(表3)。此外，正常腸黏膜組織中幾乎無熒光顯示(P＜0.01)。

表2 ART1、VEGF和整合素αVβ3的表達與大腸癌臨床病理學特征的關(guān)系Table 2 The relation of the expression of ART1，VEGF and integrin αVβ3 with the clinpathological characteristics of colorectal carcinoma

圖2 ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3在大腸癌組織中的共表達Fig 2 The co-expression of ART1/VEGF and ART1/integrin αVβ3 in colorectal carcinoma by immunofluorescence double staining(×400)

表3 大腸癌組織中ART1與VEGF和整合素αVβ3表達的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis of expression of ART1 with VEGF and integrin αVβ3 in colorectal carcinoma

2.3 大腸癌微血管計數(shù)

采用CD34標記大腸癌組織中的微血管內(nèi)皮細胞，可見腸癌組織中不同區(qū)域微血管大小、形態(tài)及密度有明顯區(qū)別。微血管密度較高的區(qū)域血管多為單個CD34陽性細胞或陽性實心細胞團，無明顯管腔，部分小血管管腔不規(guī)則，部分小血管呈樹枝狀;微血管密度較低的區(qū)域則單個CD34陽性細胞及實心細胞團比較少見，血管腔圓形或橢圓形，管腔直徑較大，形狀相對規(guī)則且數(shù)量少(圖3)。統(tǒng)計學顯示，在20例ART1表達較強或ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3共表達較強烈的大腸癌組織微血管密度較高，而 ART1陰性或 ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3均不表達的大腸癌組織中血管密度低(P＜0.01)(表4)。

圖3 CD34在大腸癌組織中的表達Fig 3 The expression of CD34 in colorectal carcinoma by immunohistochemical staining(×200)

表4 ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3共表達組與非共表達組微血管密度的比較Table 4 The comparison of microvessel density between co-expressed group and non-co-expressed group(±s，n=20)

*P ＜0.01 compared with group of non-co-expression．

group ART1/VEGF ART1/integrin αVβ3 co-expression 25.4±8.3* 22.3±5.9*non-co-expression 5.5±2.0 8.1±3.3

3 討論

ART1是精氨酸特異性單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶，催化NAD+的ADP核糖基轉(zhuǎn)移到受體蛋白質(zhì)的精氨酸殘基上，修飾該蛋白質(zhì)并改變該蛋白質(zhì)的活性，參與細胞分化與增殖。

文獻報道ART1可以糖基化血小板衍生生長因子 BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)，調(diào)節(jié)PDGF-BB與其受體的結(jié)合以及其信號傳導(dǎo)能力，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ART1的成纖維細胞表面ART1衰減的同時，PDGF-BB與其受體的結(jié)合也受到了抑制［7］。在骨骼肌細胞中，整合素α7也可成為ARTs的底物，接受其調(diào)節(jié)從而改變相關(guān)功能［8］。使用ART1特異性抑制劑MIBG作用于人骨骼肌細胞、平滑肌細胞及血管內(nèi)膜細胞，結(jié)果無論在體外還是在體內(nèi)，MIBG可以明顯抑制這些細胞的生長和增殖，有力證實了ART1對細胞生長和增殖的作用，但其機制仍不清楚［9－11］。由于 MIBG是小分子精氨酸的類似物，可作為ART1的底物，競爭性地與ART1相結(jié)合，因此推測，MIBG與ART1結(jié)合可能影響細胞因子的翻譯后修飾，改變了生長因子的結(jié)構(gòu)，從而影響信號傳導(dǎo)通路，阻止了細胞對生長因子的反應(yīng)。在對視網(wǎng)膜ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶的研究中發(fā)現(xiàn)ARTs可直接調(diào)節(jié)磷酸二酯酶的功能，改變細胞信號傳導(dǎo)過程［12］。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和整合素 αVβ3(integrin αVβ3)是參與腫瘤血管生成的重要生長因子，與ART1的關(guān)系尚未見文獻報道。VEGF結(jié)構(gòu)上歸屬于PDGF，通過受體VEGFR2/KDR刺激內(nèi)皮細胞活化，降解基底膜，邊遷移邊增殖并形成新的血管［13］。整合素αVβ3位于細胞膜，作為一種信號受體能夠誘導(dǎo)蛋白酪氨酸磷酸化以傳遞細胞信號，參與VEGF誘導(dǎo)的血管生成，刺激腫瘤生長和VEGF進一步的產(chǎn)生以支持血管生成［14］。本實驗觀察了大腸癌組織中ART1、VEGF及整合素αVβ3的表達。結(jié)果顯示大腸癌組織中ART1表達增強，且ART1與VEGF和整合素 αVβ3的表達正相關(guān);且 ART1/VEGF、ART1/整合素αVβ3共表達組微血管密度增高，提示ART1的表達可能促進腫瘤組織血管生成，推測ART1可能通過對VEGF和整合素αVβ3的核糖基化修飾來影響該因子信號傳導(dǎo)通路，進而影響腫瘤細胞的血管生成。

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The correlation of ART1 expression with angiogenesis in colorectal carcinoma and it relationship with VEGF and integrin αVβ3 expressions

YANG Lian，WANG Ya-lan*，SHENG Yong-tao，XIONG Wei，XU Jian-xia，TANG Yi，LI Xian

(Dept．of Pathology，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo study correlation of the ART1 expression on VEGF and integrin αVβ3 expression and the effect of ART1 on microangiogenesis in colorectal carcinoma．MethodsImmunohistochemical was used to detect the expression of ART1，VEGF and integrin αVβ3，and immunofluorescence double staining was used to detect coexpression of ART1/VEGF and ART1/integrin αVβ3;and the microvascular density(MVD)quantified by Chalkley analysis．ResultsThe expressions of ART1，VEGF and integrin αVβ3 were significantly higher than in the control group(P＜0.05)，and there was a positive correlation of ART1 with VEGF and integrin αVβ3(P＜0.05)．The group of co-expression of ART1/VEGF and ART1/integrin αVβ3 showed higher microvessel density(25.4 ±8.23，22.3±5.9)than non-co-expression group(5.5±2.0，8.1±3.3，P＜0.01)．ConclusionsThe activity of ART1 is increased in colorectal carcinoma tissues，and shows positive relation with the expressions of VEGF and integrin αVβ3．It may possibly induce tumor angiogenesis．

ART1;VEGF;integrin αVβ3;colorectal carcinoma;angiogenesis

R 735.34

A

1001-6325(2012)09-1064-06

2011－10－21

2011－12－28

高等學校博士學科點專項科研基金聯(lián)合資助項目(20105503110009);重慶市教委科學技術(shù)研究項目(KJ 110322)

*通信作者(corresponding author):wangyalan074@126．com