宋銀宏，何 苗，符策崗，龍春燕，汪 磊，王 想，吳林蓉

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北宜昌443002)

氯普魯卡因誘導(dǎo)體外人宮頸癌細(xì)胞抑癌基因CDH1、APC和P16啟動(dòng)子去甲基化及基因表達(dá)

宋銀宏*，何 苗，符策崗，龍春燕，汪 磊，王 想，吳林蓉

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，湖北宜昌443002)

目的 觀察氯普魯卡因(CP)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa和CaSki的抑癌基因CDH1、APC及P16啟動(dòng)子甲基化水平和基因表達(dá)的影響。方法 用不同終濃度的CP(0、1、1.5、2、3和4 mmol/L)處理癌細(xì)胞系HeLa和CaSki及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率;用甲基化特異性PCR(MSP)和RT-PCR檢測(cè)1.5 mmol/L CP處理后各細(xì)胞CDH1、APC及P16啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及基因表達(dá)水平。結(jié)果 1.5 mmol/L CP作用96 h后，HeLa和CaSki抑制率分別為66.17% ±5.82%和69.12% ±6.89%，顯著高于HUVEC的21.78% ±3.12%，1.5 mmol/L CP處理宮頸癌細(xì)胞96 h后，CDH1、APC及P16基因啟動(dòng)子均有不同程度去甲基化，3種基因mRNA均增強(qiáng)或者恢復(fù)了表達(dá)。結(jié)論 CP可以抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa和CaSki增殖，誘導(dǎo)HeLa和CaSki的CDH1、APC及P16基因啟動(dòng)子去甲基化，并可增加或者恢復(fù)相應(yīng)基因的表達(dá)。

氯普魯卡因;宮頸癌;抑癌基因;DNA甲基化

普魯卡因(procaine)是沿用多年的局麻藥，研究發(fā)現(xiàn)普魯卡因有去甲基化效應(yīng)，并對(duì)肝癌［1］和肺癌細(xì)胞［2］等的生長有抑制作用，但其會(huì)使患者產(chǎn)生過敏癥狀甚至導(dǎo)致死亡［3］，因此臨床使用受到一定局限。氯普魯卡因(chloroprocaine，CP)是其衍生物，可安全、廣泛地應(yīng)用于臨床麻醉［4］。與普魯卡因相比，很少發(fā)現(xiàn)過敏的臨床報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用CP作用人宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki及正常細(xì)胞系人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，以細(xì)胞生長抑制率及上皮型鈣黏蛋白基因(E-cadherin，又稱CDH1)、多瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1，MTS1，又稱P16)及腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白基因(adenomatous polyposis coli，APC)3種抑癌基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，評(píng)價(jià)CP是否具有去甲基化并恢復(fù)抑癌基因表達(dá)的效應(yīng)，為臨床采用新的更安全的去甲基化藥物治療宮頸腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、藥品及試劑

人宮頸癌細(xì)胞系CaSki(三峽大學(xué)湖北省免疫重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏)，人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC(CCTCC)，氯普魯卡因(CP)(中國晉城海斯制藥有限公司)，MTT(Amresco公司)，基因組DNA提取試劑盒(Biomiga公司)，Trizol試劑及寡核苷酸引物(Invitrogen公司)，DNA修飾試劑盒EZ DNA MethylationTMKit(Zymo公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit及熱啟動(dòng)酶Maxima Hot Start PCR Master Mix(Fermentas公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Biochrom AG公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT實(shí)驗(yàn)

常規(guī)條件培養(yǎng)HeLa、CaSki及HUVEC。選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將HeLa和CaSki于3 000個(gè)/孔、HUVEC于4 000個(gè)/孔鋪96孔板，分別用0、1、1.5、2、3 和4 mmol/L CP 處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè) 4個(gè)復(fù)孔，每24 h換1次含藥液新鮮培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)48、72及96 h，按常規(guī)方法行MTT實(shí)驗(yàn)，最后在全波長酶標(biāo)儀選擇570 nm測(cè)吸光度值(A570)，細(xì)胞生長抑制率=(陰性對(duì)照組A570－實(shí)驗(yàn)組A570)/陰性對(duì)照組A570×100%。

1.3 細(xì)胞加藥處理

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，HeLa和CaSki 2×105/孔，HUVEC 3×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，用上述MTT實(shí)驗(yàn)篩選出的對(duì)宮頸癌細(xì)胞均有顯著抑制作用，而對(duì)HUVEC無明顯抑制作用的1.5 mmol/L CP處理各細(xì)胞，隔天更換含藥液新鮮培養(yǎng)液，分別處理4及5 d后收集細(xì)胞，不加藥處理的各種細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.4 基因組DNA的提取和亞硫酸氫鹽修飾

用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，用微量蛋白/核酸定量儀測(cè)其濃度和純度。各個(gè)細(xì)胞基因組DNA均取1 μg，用DNA修飾試劑盒EZ DNA MethylationTMKit完成亞硫酸鹽修飾。

1.5 MSP檢測(cè)CDH1、APC、P16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)

各基因甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。以亞硫酸氫鈉修飾后的DNA為模板，PCR反應(yīng)體系包含5 μL的2×Hot Start PCR Master Mix、3 μL H2O、10 μmol/L上下游引物各0.5及1 μL模板。各個(gè)MSP反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;主循環(huán)為95℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。取5 μL產(chǎn)物電泳。

1.6 RT-PCR 檢測(cè) CDH1、APC、P16、HPV16-E6E7和HPV18-E6E7 mRNA的表達(dá)

用Trizol提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR按試劑盒說明進(jìn)行。各基因引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表2。PCR反應(yīng)體系同上述MSP。各個(gè)RT-PCR條件為:95℃預(yù)變性5 min;主循環(huán)為95℃變性30 s，退火60 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物電泳，應(yīng)用 Gene Genius凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以各基因和內(nèi)參照GAPDH的吸光度比值作為各基因mRNA水平相對(duì)值。

表1 MSP引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and conditions for MSP

表2 RT-PCR引物及反應(yīng)條件Table 2 Primers and conditions for RT-PCR

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CP對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa、CaSki及正常細(xì)胞HUVEC增殖的影響

鏡下觀察，癌細(xì)胞體積變小、皺縮變圓、核分裂象少見。HUVEC雖也有類似現(xiàn)象，但數(shù)量少。在0～4 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加和作用時(shí)間延長，CP對(duì)細(xì)胞生長抑制率均逐漸增大 (P＜0.01)。用1.5 mmol/L CP連續(xù)處理96 h后，對(duì)HeLa和CaSki的抑制率均顯著高于HUVEC細(xì)胞(P＜0.01)(圖1)。

2.2 CP對(duì)3種細(xì)胞抑癌基因CDH1、APC和P16啟動(dòng)子甲基化的影響

圖1 1.5 mmol/L CP顯著抑制HeLa、CasKi增殖但對(duì)HUVEC抑制作用不明顯Fig 1 1.5 mmol/L CP inhibited the growth of HeLa and CaSki significantly but not affect the growth of HUVEC apparently

1)CP處理前:CaSki的CDH1、APC和P16基因均既擴(kuò)增出甲基化條帶，也擴(kuò)增出非甲基化條帶。HeLa的CDH1和APC基因只擴(kuò)增出甲基化條帶，而未見非甲基化條帶;P16基因則兩種條帶均有。而HUVEC的CDH1、APC和P16均只能擴(kuò)增出非甲基化條帶(圖2A)。2)1.5 mmol/L CP處理96 h后:CaSki的CDH1和APC基因的非甲基化產(chǎn)物條帶明顯變亮，而甲基化產(chǎn)物條帶顯著變淡;P16基因則只擴(kuò)增出非甲基化條帶。HeLa的CDH1基因仍然有較明顯的甲基化條帶，但已可見擴(kuò)增出非甲基化條帶;APC基因的甲基化條帶變淡，且出現(xiàn)了非常明顯的非甲基化條帶;P16基因則只擴(kuò)增出非甲基化條帶。HUVEC處理后，其CDH1、APC和P16基因仍只有非甲基化條帶(圖2B)。3)1.5 mmol/L CP處理120 h后:3種細(xì)胞的CDH1、APC和P16基因均只擴(kuò)增出非甲基化條帶(圖2C)。

2.3 CP對(duì)3種細(xì)胞的CDH1、APC和P16基因表達(dá)的影響

1.5 mmol/L CP處理96 h前后，CaSki和 HeLa細(xì)胞中均有P16mRNA表達(dá);CaSki細(xì)胞在處理前后，CDH1、APC和HPV16E6E7mRNA表達(dá)均為陽性，HPV18E6E7mRNA表達(dá)均為陰性;HeLa細(xì)胞在處理前CDH1和APCmRNA表達(dá)均為陰性，處理后均轉(zhuǎn)為陽性，其HPV18E6E7mRNA表達(dá)始終為陽性，HPV16E6E7mRNA表達(dá)始終為陰性(圖3)。CaSki細(xì)胞處理后，CDH1、APC及P16mRNA表達(dá)均顯著增加(分別為P＜0.01、P＜0.05和P＜0.01)，而 HPV16E6E7mRNA表達(dá)則降低(P＜0.01)，HPV18E6E7mRNA表達(dá)仍為陰性;HeLa細(xì)胞處理后，CDH1及APCmRNA表達(dá)由陰性轉(zhuǎn)為陽性，并且P16mRNA表達(dá)顯著上升(P＜0.01)，HPV16E6E7mRNA和HPV18E6E7mRNA的表達(dá)則維持不變(表3)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化使其表達(dá)沉默是腫瘤發(fā)生的重要原因［5］。宮頸癌在我國居?jì)D科腫瘤之首，其細(xì)胞系和癌組織標(biāo)本中也存在P16［6－7］、APC［8－9］及CDH1［6］等抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。P16屬細(xì)胞周期調(diào)控基本基因，其編碼產(chǎn)物P16蛋白是細(xì)胞素依賴性激酶4、6(CDK4、6)抑制物，可負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老;APC編碼的APC蛋白是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，若其表達(dá)異常，則最終啟動(dòng)增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄;CDH1決定上皮型鈣黏蛋白表達(dá)，其結(jié)構(gòu)與功能變化直接關(guān)系癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。有報(bào)道P16基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌中占57%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CDH1甲基化率在宮頸癌組織中達(dá)到52%［6］;宮頸癌中APC基因啟動(dòng)子甲基化率明顯比正常組織高［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CDH1、APC和P16在 CaSki中均為半甲基化;在HeLa中P16為半甲基化，CDH1和APC為完全甲基化;而在HUVEC中均為非甲基化狀態(tài)，這與上述報(bào)道基本一致。這些基因由于甲基化而降低表達(dá)或表達(dá)缺失與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示糾正這些基因異常甲基化可使失活基因重新表達(dá)而逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的惡性行為。

圖2 CP對(duì)HeLa和CasKi的CDH1、APC和P16基因有去甲基化作用，對(duì)HUVEC各基因無影響Fig 2 CP induced demethylation of CDH1，APC and P16 gene in HeLa and CaSki cells but had no effect on those genes of HUVEC cells

圖3 CP對(duì)各個(gè)細(xì)胞抑癌基因及癌基因表達(dá)的影響Fig 3 The effect of CP on the expression of CDH1，APC，P16 and HPV-E6E7 genes in HUVEC，CasKi and HeLa cells

表3 CP誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞抑癌基因表達(dá)增強(qiáng)或者恢復(fù)表達(dá)而癌基因表達(dá)不變或減少Table 3 CP could recover or increase the tumor suppressor genes'expression but not increase the oncogenes'expression in cervical cancer cells(±s)

表3 CP誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞抑癌基因表達(dá)增強(qiáng)或者恢復(fù)表達(dá)而癌基因表達(dá)不變或減少Table 3 CP could recover or increase the tumor suppressor genes'expression but not increase the oncogenes'expression in cervical cancer cells(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with untreated group．

gene ed treated CDH1 0.95±0.07 1.05±0.02 0.32±0.07 0.78±0.06＊＊HUVEC CaSki HeLa untreated treated untreated treated untreat－0.42±0.07 0.48±0.04 0.12±0.03 APC 0.79±0.07 0.83±0.01 0.29±0.03 0.38±0.03* － 0.92±0.02 P16 0.97±0.05 0.99±0.02 0.53±0.07 0.95±0.06＊＊ 0.40±0.04 0.91±0.08＊＊HPV16-E6E7 － － 1.03±0.07 0.85±0.09＊＊ － －HPV18-E6E7－－－－

現(xiàn)最常用DNA甲基化抑制劑為5-氮雜脫氧胞苷等胞苷類似物［10－11］，由于細(xì)胞毒性較強(qiáng)且致突變，臨床應(yīng)用受限，因此不少研究致力于發(fā)現(xiàn)有相同去甲基化作用且毒性小的藥物。已發(fā)現(xiàn)肼苯噠嗪、Zebularine、普魯卡因及普魯卡因胺等藥物均有去甲基化作用，且毒副作用?。?，12］。普魯卡因由于不少患者用后會(huì)產(chǎn)生過敏甚至死亡，在臨床使用受到一定局限。CP是一種普魯卡因衍生物，已證實(shí)其比普魯卡因起效快，且副作用小，已安全、廣泛應(yīng)用于臨床麻醉［4］。本實(shí)驗(yàn)用1.5 mmol/L CP處理96 h時(shí)，CaSki和 HeLa的生長抑制率均大于 65%，而HUVEC表現(xiàn)為耐藥。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CaSki細(xì)胞原本半甲基化的CDH1和APC基因轉(zhuǎn)向非甲基化;而HeLa細(xì)胞原本完全甲基化的CDH1和APC基因部分去甲基化;兩個(gè)癌細(xì)胞中半甲基化的P16基因則在CP作用后均完全去甲基化。而且還發(fā)現(xiàn)，CaSki細(xì)胞3種抑癌基因的mRNA表達(dá)水平均顯著增加，但癌基因HPV16E6E7表達(dá)并無增加，反有下降趨勢(shì)，另外CP作用前后均未擴(kuò)增出HPV18E6E7產(chǎn)物，這與CaSki為 HPV16陽性相符;CP作用于 HeLa后，CDH1和APC基因mRNA的表達(dá)從陰性轉(zhuǎn)為陽性，同時(shí)P16基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，而癌基因 HPV18E6E7的表達(dá)沒有顯著改變，CP作用前后均未擴(kuò)增出HPV16E6E7產(chǎn)物，這與HeLa為HPV18陽性相符。為進(jìn)一步探討CP去甲基化作用，本研究又延長其對(duì)細(xì)胞的處理時(shí)間至120 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此時(shí)癌細(xì)胞的抑癌基因均完全去甲基化，說明隨時(shí)間延長CP的去甲基化作用增強(qiáng)。這些結(jié)果均提示:宮頸癌細(xì)胞中CDH1、APC和P16的表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)相關(guān)，CP對(duì)甲基化或者半甲基化的抑癌基因具有一定去甲基化作用，并能增強(qiáng)或恢復(fù)抑癌基因的表達(dá);另一方面，CP對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用并沒有增加癌基因E6E7的表達(dá)，對(duì)CaSki細(xì)胞作用后，甚至能減少E6E7表達(dá)。這說明CP抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能不止是對(duì)抑癌基因的去甲基化作用。

綜上所述，CP能在一定濃度抑制宮頸癌細(xì)胞生長，但對(duì)正常細(xì)胞卻無明顯抑制作用，且CP同普魯卡因一樣，也具有一定的去甲基化作用，并增加或恢復(fù)抑癌基因的表達(dá);另一方面，由于CP在臨床上具有效果好，安全性更高等優(yōu)勢(shì)，則在以后去甲基化治療中可以優(yōu)先考慮CP而不是普魯卡因。

［1］Tada M，Imazeki F，F(xiàn)ukai K，et al．Procaine inhibits the proliferation and DNA methylation in human hepatoma cells［J］．Hepatol Int，2007，1:355 －364．

［2］Gao Z，Xu Z，Hung M，et al．Procaine and procainamide inhibit the Wnt canonical pathway by promoter demethylation of WIF-1 in lung cancer cells［J］．Oncol Rep，2009，22:1479－1484．

［3］耿青．預(yù)防與減少普魯卡因引起過敏反應(yīng)的對(duì)策［J］．海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2000，6:55．

［4］傅潤喬，田玉科．CP麻醉進(jìn)展［J］．中國新藥與臨床雜志，2006，25:949－954．

［5］Taberlay PC，Jones PA．DNA methylation and cancer［J］．Prog Drug Res，2011，67:1 －23．

［6］Jeong DH，Youm MY，Kim YN，et al．Promoter methylation of p16，DAPK，CDH1，and TIMP-3 genes in cervical cancer:correlation with clinicopathologic characteristics［J］．Int J Gynecol Cancer，2006，16:1234 －1240．

［7］Attaleb M，Elhamadani W，Khyatti M，et al．Status of p16(INK4a)and E-cadherin gene promoter methylation in Moroccan patients with cervical carcinoma［J］．Oncol Res，2009，18:185－192．

［8］宋銀宏，張昌菊．肼苯噠嗪對(duì)宮頸癌細(xì)胞系A(chǔ)PC基因異常甲基化的影響［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:981－984．

［9］Wisman GB，Nijhuis ER，Hoque MO，et al．Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia［J］．Int J Cancer，2006，119:1908 －1914．

［10］張愛鳳，張師前，位玲霞．5-氮-2'-脫氧胞苷對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡及HMLH1和HMSH2表達(dá)的影響［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:412－416．

［11］劉麗喬，羅達(dá)亞，付晶晶，等．5-Aza-CdR對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞系P16基因甲基化狀態(tài)及其生物學(xué)表型的影響［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:161－165．

［12］Szyf M．DNA methylation and demethylation probed by small molecules［J］．Biochim Biophys Acta，2010，1799:750－759．

Effects of chloroprocaine on the methylation status and the expression of CDH1，APC and P16 genes in human cervical cancer cells in vitro

SONG Yin-hong*，HE Miao，F(xiàn)U Ce-gang，LONG Chun-yan，WANG Lei，WANG Xiang，WU Lin-rong

(Dept．of Immunology，Medical College，Three Gorges University，Yichang 443002，China)

ObjectiveTo investigate the effects of chloroprocaine(CP)on the methylation status and the expression ofCDH1，APCandP16genes in human cervical cancer cell lines HeLa and CaSki．MethodsHeLa，CaSki and the normal human cell HUVEC culturedin vitrowere exposed to different concentrations(0，1，1.5，2，3 and 4 mmol/L)CP．The growth inhibition of the three cell lines treated at 48，72 and 96 h were studied by MTT assay．The three cell lines were all treated by the certain concentration CP which inhibited the growth of HeLa and CaSki significantly but not affect the growth of HUVEC apparently．The methylation status and the expression ofCDH1，APCandP16genes in the three cell lines were analyzed by methylated specific-PCR(MSP)and RT-PCR，respectively．ResultsAfter being treated by 1.5 mmol/L CP for 96 h，the inhibition rates of HeLa and CaSki were 66.17% ±5.82%and 69.12% ±6.89%，which were significantly higher than that of HUVEC，21.78% ±3.12%．CDH1，APCandP16genes were all demethylated at different levels and mRNA expression of the three genes were recovered or increased in HeLa and CaSki cells after treated by 1.5 mmol/L CP for 96 h．ConclusionsCP may inhibit the growth of HeLa and CaSki cells，meanwhile，it could demethylateCDH1，APCandP16genes and recover or increase the genes'expression in the two cervical cancer cells．

chloroprocaine;cervical cancer;tumor suppressor genes;DNA methylation

R 737.3

A

1001-6325(2012)09-1070-06

2011－10－09

2011－12－28

湖北省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(Q20121306);三峽大學(xué)博士啟動(dòng)基金(KJ2010B047);三峽大學(xué)2011大學(xué)生科研創(chuàng)新基金(2011XGK011)

*通信作者(corresponding author):syh728@126．com