韋舟玲 龐麗紅 楊冬梅 黎歐陽 石 凌

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市 530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市530021)

VEGF在早期自然流產(chǎn)患者血清及絨毛組織中的表達(dá)及臨床意義▲

韋舟玲1龐麗紅2*楊冬梅2黎歐陽2石 凌2

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市 530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市530021)

目的觀察孕早期自然流產(chǎn)患者血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在血清及絨毛組織中的表達(dá)水平，探討VEGF與妊娠關(guān)系。方法選擇孕早期自然流產(chǎn)患者25例為觀察組，正常早期妊娠婦女25例為對照組，應(yīng)用ELISA法檢測血清VEGF含量，采用免疫組織化學(xué)方法測定各組孕婦絨毛組織VEGF的表達(dá)。結(jié)果正常早孕組與孕早期胚胎停育患者血清及絨毛VEGF表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論VEGF表達(dá)異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有相關(guān)性，其表達(dá)水平升高可能是導(dǎo)致孕早期胚胎停育的原因之一。

血管內(nèi)皮生長因子;自然流產(chǎn);酶聯(lián)免疫吸附測定;免疫組織化學(xué)

近年來的研究表明，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與胎盤組織中血管增生平衡和胎兒血液供應(yīng)不足有密切關(guān)系，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最主要的促進(jìn)血管形成的血管形成增生調(diào)節(jié)因子，在保持蛻膜組織中血管密度、有效血流量和維持胎兒營養(yǎng)供應(yīng)上起重要作用。成功的妊娠依賴于胎盤良好的發(fā)育和生長，在胎盤植入和胎盤形成的過程中，血管的生成對于成功妊娠是非常關(guān)鍵的。雖然對于胎盤血管生成的調(diào)控因素還不清楚，但人們已認(rèn)識(shí)到胎盤血管的發(fā)育是由多種生長因子及其受體調(diào)節(jié)完成，這些因子的不正常表達(dá)可能導(dǎo)致胎盤血運(yùn)障礙，在胎盤形成過程中血管功能不全是導(dǎo)致自然流產(chǎn)等產(chǎn)科并發(fā)癥的重要因素［1］。

國內(nèi)外一些學(xué)者認(rèn)為，VEGF升高導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生［2］，VEGF表達(dá)水平降低可能也與流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)［3］。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫組織化學(xué)測定自然流產(chǎn)胚胎停育時(shí)患者的外周血清及絨毛組織中VEGF表達(dá)情況，探討VEGF水平及表達(dá)在胚胎停育中可能產(chǎn)生的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年9月至2011年11月在我院門診就診的25例胚胎剛停育的自然流產(chǎn)患者作為觀察對象，患者年齡25～36歲，均排除解剖、遺傳、感染等因素，孕8周前曾B超檢查提示胚胎發(fā)育良好，可見原始心管搏動(dòng)，孕8～12周，經(jīng)臨床病史、體征、B超、尿人絨毛膜促性腺激素(hCG)檢測確定已經(jīng)發(fā)生難免流產(chǎn)者。選取同期在我院計(jì)生門診要求進(jìn)行人工流產(chǎn)的健康早孕婦女25例為對照組，年齡25～36歲，孕8～12周，年齡、孕周與自然流產(chǎn)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并均符合以下要求:①本次妊娠以前有過正常妊娠和分娩史，無死胎、死產(chǎn)、自然流產(chǎn)史;②本次妊娠期間無先兆流產(chǎn)癥狀和體征;③B超提示胚胎發(fā)育正常;④無服藥及病毒感染史，無其他內(nèi)科疾病。

1.2 外周血VEGF水平的檢測 標(biāo)本采集取自自然流產(chǎn)25例孕婦早晨空腹時(shí)肘靜脈血 2 mL，靜止 1 h后，2000 r/min離心15 min，取血清置于－70℃冰箱保存待測;取對照組孕婦肘靜脈血，同法處理。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定已分離保存的血清中VEGF濃度。操作按試劑盒(購自美國R＆D System公司)的說明書進(jìn)行。所有標(biāo)本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔且為同批測定，均值為最終濃度，批內(nèi)變異＜5%，由專人檢測。

1.3 免疫組化法檢測絨毛組織VEGF蛋白水平

1.3.1 絨毛的采集與保存 將手術(shù)后采集的絨毛組織用0.9%生理鹽水沖洗后立即置于4%的甲醛液中固定24～48 h，常規(guī)石蠟包埋后制成4～5 μm厚的組織切片。

1.3.2 試劑及方法 采用免疫組化二步法染色，觀察絨毛組織中 VEGF的分布及表達(dá)。一抗為鼠抗人 VEGF及sFlt-1單克隆抗體工作液，即用型Envisio TM試劑盒，DAB均購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。染色步驟參照說明書進(jìn)行。用已知的陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。切片集中染色，以免批內(nèi)、批間誤差。

1.3.3 結(jié)果判定 采用雙盲法觀察陽性反應(yīng)。VEGF表達(dá)陽性信號(hào)為棕黃色，位于胞漿，每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比分為4級，陰性(－):陽性細(xì)胞數(shù)＜5%;陽性(+):陽性細(xì)胞數(shù)5% ～25%;中度陽性(++):陽性細(xì)胞數(shù)25% ～50%;強(qiáng)陽性(+++):陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自然流產(chǎn)組和對照組孕婦外周血中 VEGF檢測 ELISA法測定兩組孕婦外周血清中VEGF水平，顯示資料符合正態(tài)分布，結(jié)果見表1。自然流產(chǎn)組外周血中VEGF 的水平為(2 037.20±1 125.09)ng/L，遠(yuǎn)高于對照組外周血中 VEGF 的水平［(882.67 ±595.47)ng/L］。兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 外周血VEGF水平比較 (±s)

表1 外周血VEGF水平比較 (±s)

注:自然流產(chǎn)胚胎停育組與正常健康早孕組比較，P＜0.01。

組別 n 外周血VEGF水平(ng/L)自然流產(chǎn)胚胎停育組25 2 037.20 ±1 125.09正常健康早孕組25 882.67 ±5955.47

2.2 自然流產(chǎn)胚胎停育及正常早孕絨毛組織VEGF蛋白表達(dá) 自然流產(chǎn)胎停育組絨毛組織VEGF蛋白表達(dá)水平較正常早孕組高，陽性細(xì)胞大于50%的率也較正常健康早孕組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2、圖1及圖2。

表2 兩組絨毛上皮組織合體滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達(dá)

圖1 RSA組絨毛VEGF的免疫組化(蘇木素復(fù)染×400)

圖2 正常早孕組絨毛VEGF的免疫組化(蘇木素復(fù)染×400)

3 討論

早期自然流產(chǎn)是產(chǎn)科常見的病理性妊娠之一，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制仍不明確。VEGF作為一種主要的血管內(nèi)皮細(xì)胞促血管生長因子，具有使微靜脈、小靜脈通透性增加，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和細(xì)胞漿中鈣離子聚集等作用。Krussel等［4］研究證實(shí)VEGF在人類胚胎種植前的胚胎上的表達(dá)對于著床過程中的血管形成是必需的;他們用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測了在IVF過程中獲得的19個(gè)人類囊胚期胚胎，發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA在89%的胚胎上表達(dá)。

葉喜陽等［2］研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)自然流產(chǎn)(RSA)患者的血清及絨毛中VEGF水平較正常早孕者升高，與我們研究的結(jié)果相符。Nagamatsu等［5］認(rèn)為，妊娠早期胚胎是在一個(gè)相對缺氧的環(huán)境中發(fā)育的，其后隨著滋養(yǎng)層細(xì)胞的不斷侵入，胎盤供氧改善，母胎物質(zhì)交換得以完善，在缺氧條件下sFlt-mRN表達(dá)明顯升高。病理妊娠時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤表淺與螺旋動(dòng)脈重鑄不良的直接后果是子宮胎盤血流灌注不足和缺血、缺氧，這對滋養(yǎng)層細(xì)胞乃至整個(gè)胎盤的功能產(chǎn)生重要影響，并與子癇前期等妊娠疾病的病理機(jī)制有關(guān)［6，7］。體內(nèi)和體外由低氧誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)的低氧環(huán)境使VEGF mRNA出現(xiàn)高表達(dá)。

本研究顯示，自然流產(chǎn)胚胎停育患者血清及絨毛組織中VEGF的表達(dá)水平均高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。自然流產(chǎn)胎停育患者較正常早孕絨毛組織VEGF蛋白表達(dá)水平高，提示胚胎停育的發(fā)生可能與患者血清VEGF和妊娠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平增高有關(guān)。Neufeld等［8］研究推測，低氧VEGFR表達(dá)增加的機(jī)制可能為:HIF-1與其在VEGF啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，介導(dǎo)了低氧誘導(dǎo)的VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄，致使VEGF產(chǎn)生增加。

本研究表明VEGF表達(dá)異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)具有相關(guān)性，其表達(dá)水平升高可能是導(dǎo)致孕早期胚胎停育的原因之一。但VEGF對自然流產(chǎn)的作用機(jī)制尚未完全闡明，對VEGF進(jìn)行深入研究，為自然流產(chǎn)患者提供臨床防治依據(jù)是我們今后的努力方向。

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Expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor in the serum and chorionic villi in patients of early spontaneous abortion

WEI Zhou-ling，PANG Li-hong ，Li Ou-yang(Department of Obstetrics and Gynecology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo observe the expression level of vascular endothelial growth factor(VEGF)in the serum and chorionic villus of embryo growth arrest patients，and to explore the relationship between VEGF and early spontaneous abortion.MethodsIn 25 cases of early spontaneous abortion and 25 cases of normal early pregnancy groups，the level of VEGF in serum was measured by enzyme － linked immunosorbent assay and expression of chorionic villus tissue was detected by immunohistochemistry.ResultsThe level of VEGF expressions in both serum and chorionic villus tissue were increased in embryo growth arrest patients compared to those in controls(P ＜0.01).ConclusionThere are relationship between the abnormal expression of VEGF and early spontaneous abortion.The high expression of VEGF may be involved in the pathogenesis of embryo growth arrest.

Vascular endothelial growth factor;Spontaneous abortion;Enzyme-linked immunosorbent assay;Immunohistochemistry

R 714.21

A

1673-6575(2012)06-0582-03

國家自然科學(xué)基金(81060053);廣西2011年研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011105981002M212);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻11217004)

韋舟玲(1986～)，女，碩士研究生，研究方向 :母親胎兒醫(yī)學(xué)。

*通訊作者

2012-07-28

2012-09-27)