魯 藝， 程發(fā)峰， 暢洪升， 鐘相根， 王慶國

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 北京 100102)

體內(nèi)過多的活性氧(ROS)引起的氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是涉及人類多種疾病的發(fā)展與生理功能改變的一個(gè)重要因素。ROS是一類化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷暮踉踊蛟訄F(tuán)，主要包括超氧陰離子自由基(02-)、羥自由基(-OH)和過氧化氫(H2O2)等。自由基增多對(duì)機(jī)體的毒害作用是多方面的，其中最容易受到攻擊的是細(xì)胞膜及脂蛋白中的多聚不飽和脂肪酸，導(dǎo)致所謂的脂質(zhì)過氧化。自由基可以通過氧化、交聯(lián)、肽鏈斷裂或聚集等方式使蛋白質(zhì)、脂蛋白、酶蛋白、受體蛋白變性，引起酶失活和腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能損傷、壞死；也可以破壞RNA、DNA，引起基因突變，使轉(zhuǎn)錄異常、DNA復(fù)制異常，使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)及癌變，細(xì)胞也可能因此而死亡。腦組織由于耗氧量較高而抗氧化酶活性較低，容易遭受自由基等氧化劑的損傷。因此，應(yīng)用抗氧化劑清除大腦中起到破壞作用的自由基，對(duì)于預(yù)防和治療中風(fēng)以及神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。

清開靈在清熱解毒通絡(luò)機(jī)理方面已進(jìn)行了深入研究，但其體外抗氧化能力及其相關(guān)機(jī)制尚缺乏足夠的證據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)從抗氧化反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，在化學(xué)反應(yīng)體系及基于細(xì)胞活性的生物體外反應(yīng)體系中，分別觀察了清開靈對(duì)自由基的清除能力、對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用以及對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，并與已知的天然抗氧化劑槲皮素進(jìn)行比較來研究清開靈的體外抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 Xanthine，xanthine oxidase(XO)，hypoxanthine，XTT，MTT 購自Sigma，Taufkirchen，Germany。清開靈注射液由北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠提供，槲皮素(quercetin)由FU實(shí)驗(yàn)室提供。SK-N-SH人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，購自 American Type Culture Collection(ATCC，No.HTB-11)。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(sigma公司，D5796)，500 mL DMEM中加入5mL Na3PO4(sigma公司，10101-89-0)，5 mL非必需氨基酸溶液(GIBCO公司，1127865)及50 mL胎牛血清(Hyclone公司，SH30070)，胰蛋白酶(美國sigma公司，T4799)。

1.2 方法

1.2.1 XO/XTT體系中自由基清除能力檢測(cè) 模擬人體黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生O2-。參照Ukeda 等[1]方法操作，簡(jiǎn)述如下：50 mM Na2CO3buffer 調(diào)整PH值為10，取25 mL，與3 mM xanthine，3 mM EDTA，1.6 Mmxtt溶液各1 mL混合，充分混合溶解后，將溶液轉(zhuǎn)入96孔酶標(biāo)盤中，每孔230 μL。清開靈稀釋為濃度分別為100、10、1 mg/mL，對(duì)照組加入等量的0.2% DMSO溶液。槲皮素作為陽性對(duì)照物。起始反應(yīng)前每孔加入10 mL xanthine oxidase(0.056 unit)，反應(yīng)1 h。1 h后測(cè)定470 nm處吸光度。以對(duì)照孔的吸光度值代表對(duì)照組O2-的量為100%，其余各組超氧陰離子以百分?jǐn)?shù)表示，(各組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

1.2.2 黃嘌呤氧化酶致尿酸生成檢測(cè) 試管中分別加入40 mM Na2CO32.5、0.1 mM EDTA，0.04 mL，mM xanthine 0.04 mL and 0.04 mL 清開靈與槲皮素溶液并充分混合。反應(yīng)開始前加入0.01 mL xanthine oxidase(0.04 Units)在293 nm分光光度儀檢測(cè)吸光度。

1.2.3 SK-N-SH細(xì)胞的培養(yǎng) SK-N-SH細(xì)胞在含10%胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，3 d換1次液，5 d傳一代。傳代時(shí)，先倒掉舊培養(yǎng)基，適量PBS液洗滌細(xì)胞1次以除去殘留培養(yǎng)基，倒掉PBS液，加入0.25%胰蛋白酶液1～2 mL，消化1 min后，輕輕拍打細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并分散游動(dòng)后，倒掉胰蛋白酶液，加入新鮮的含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基2 mL，用吸管吹打使細(xì)胞均勻分散為單層細(xì)胞，按1∶2分裝入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.4 次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷及藥物保護(hù)作用 SK-N-SH 細(xì)胞接種在96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104cells/well。24 h后將培養(yǎng)液移走，100 μM，50 μM，10 μM hypoxanthine 和2 mU/mL xanthine oxidase 溶解在 PBS中，每孔加入100 μL。分別孵育0.5、1、1.5 h。孵育相應(yīng)的時(shí)間后，用MTT法檢測(cè)各個(gè)濃度及作用時(shí)間的細(xì)胞存活率。

SK-N-SH 細(xì)胞接種在96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104cells/well。24 h后將培養(yǎng)液移走，100 μM hypoxanthine 和2 mU/mL xanthine oxidase 溶解在 PBS中，每孔加入100 μL。清開靈與槲皮素溶解在0.2%DMSO溶液中，終濃度為100、10、1 μg/mL也加入到細(xì)胞孔中，每孔100 μL。孵育 0.5、0.5 h 后，上清液吸走，換成含胎牛血清10%的MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、24 h后，新鮮配制MTT溶液，將MTT鹽溶解在PBS溶液中，使其濃度為5 mg/mL。每孔加入MTT溶液20 μL，搖床上輕輕震蕩3 min，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清，每孔加入100 lDMSO，搖床輕度震蕩15 min，待紫色沉淀充分溶解后，測(cè)OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為580 nm，參考波長(zhǎng)為620 nm。以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，其余各組按存活率(%)=(各組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 清開靈的自由基清除能力 在濃度為100 μg/mL時(shí)，清開靈的自由基清除率高達(dá)56.43±3.98%(P<0.01)，略高于槲皮素；在濃度為10 μg/mL時(shí)，清開靈的自由基清除率28.07±2.52%(P<0.05)與同濃度槲皮素相當(dāng)；在濃度為1 μg/mL時(shí)，二者自由基清除率均未與對(duì)照組顯示顯著差異。見表1。

2.2 清開靈對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用 清開靈在3個(gè)濃度均顯示顯著的抑制黃嘌呤氧化酶的作用，其在濃度100、10、1 μg/mL時(shí)，對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率分別為72.59±4，76，66.1±2.98，57.94±3.81%，說明其對(duì)黃嘌呤氧化酶具有明顯的抑制作用。見表1。

表1 自由基清除能力和黃嘌呤氧化酶活性 ±s ，%，n=8)

2.3 清開靈對(duì)次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 在生理?xiàng)l件下，次黃嘌呤(hypoxanthine，HPX)在黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)的催化下可以生成黃嘌呤，并進(jìn)一步氧化生成尿酸，同時(shí)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，大量超氧陰離子堆積可以產(chǎn)生毒性，從而引起細(xì)胞和組織損傷。本實(shí)驗(yàn)在SK-N-SH細(xì)胞模型上，應(yīng)用hypoxanthine 和xanthine oxidase反應(yīng)體系(HPX/XO)建立細(xì)胞氧化損傷模型，通過MTT比色法分析細(xì)胞存活率的變化，從而揭示清開靈對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。SK-N-SH細(xì)胞在hypoxanthine 100 μM，xanthine oxidase 2 mU/mL濃度下，作用0.5 h的條件下，細(xì)胞存活率明顯下降，為正常組的58%。見表2。所以在該濃度及作用時(shí)間下，細(xì)胞氧化損傷的模型建立成功。在此模型上，加入藥物之后可以看到，清開靈在100、10、1 μg/mL濃度下，可使細(xì)胞在HPX/XO氧化反應(yīng)損傷條件下的存活率較模型組分別有顯著提高，見表3。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)，不同濃度的HPX 在SK-N-SH細(xì)胞上對(duì)細(xì)胞生存率比較

表3 清開靈注射液對(duì)SK-N-SH細(xì)胞生存率比較或%，n=8)

4 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程?；钚匝醢℉2O2、O2·-、OH·，NO·等[2]。在病理因素作用下，氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷包括：(1)氧化DNA，攻擊核物質(zhì)，使染色質(zhì)濃縮，DNA斷裂，引起核苷酸二聚體化，復(fù)制過程出現(xiàn)錯(cuò)誤，基因表達(dá)和調(diào)控異常[3]；(2)氧化細(xì)胞內(nèi)很多重要的蛋白質(zhì)，改變其成分和活性，如酶、結(jié)構(gòu)蛋白等，使其功能改變[4]；(3)氧化細(xì)胞及亞細(xì)胞成分脂膜，引起生物膜不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成膜完整性及通透性破壞，最終導(dǎo)致膜功能障礙以及細(xì)胞溶解死亡[5]。上世紀(jì)70年代以來，生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究與實(shí)踐積累了大量資料，證明氧化應(yīng)激可導(dǎo)致人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，加速人體的衰老。近年來的研究顯示，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病主要的病理因素之一，其中包括慢性神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)，和急性腦神經(jīng)性疾病如中風(fēng)[6]。

清開靈注射液被廣泛用于治療腦病，尤其是急性中風(fēng)。目前，有文章已經(jīng)研究證實(shí)清開靈對(duì)卒中動(dòng)物模型具有良好的抗氧化作用，可以下調(diào)腦組織中MDA含量和SOD活性，并可減少ROS含量[7]。但是目前研究較多的集中在中藥對(duì)氧化終產(chǎn)物含量的干預(yù)作用上，而對(duì)生理?xiàng)l件下超氧自由基離子生成過程及環(huán)節(jié)的干預(yù)作用研究甚少。槲皮素是一種良好的抗氧化成分[8]，體外抗氧化作用主要包括直接清除超氧陰離子、羥自由基、脂質(zhì)過氧化自由基等活性氧自由基，及可以抑制黃嘌呤氧化酶活性[9～10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清開靈對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的清除作用，其清除能力與天然槲皮素相當(dāng)；在抑制黃嘌呤氧化酶作用方面，清開靈的作用優(yōu)于槲皮素?？梢姡彘_靈的抗氧化作用，不僅體現(xiàn)在清除自由基，也體現(xiàn)在干預(yù)氧化反應(yīng)的酶活性方面，揭示了清開靈可從多個(gè)環(huán)節(jié)和途徑阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。HPX/XO誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型進(jìn)一步證實(shí)了清開靈的抗氧化作用。經(jīng)過HPX/XO反應(yīng)體系處理后的SK-N-SH細(xì)胞，細(xì)胞存活率明顯下降，清開靈可顯著提高細(xì)胞生存率，進(jìn)一步顯示出清開靈良好的體外抗氧化活性。筆者也證實(shí)了清開靈在缺血性中風(fēng)及某些神經(jīng)退行性病變中有一定的治療作用[11～12]，而其從多個(gè)環(huán)節(jié)和途徑的抗氧化活性可能是其主要藥效機(jī)制之一。

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