呂海辰,齊曾鑫,傅曉鍵,蔡加彬,沈奇?zhèn)?,樸豐源
(1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 8年制臨床醫(yī)學(xué),上海 200032;2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境學(xué)教研室,遼寧,大連,116044)
甲醇(Methanol, CH3OH),是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的飽和一元醇,又稱“木醇”或“木精”,是一種無(wú)色、有毒的揮發(fā)性酒精氣味液體,可經(jīng)呼吸道、胃腸道和皮膚吸收入血,進(jìn)而導(dǎo)致中毒,是假酒的主要致毒物質(zhì)。近年因飲入假酒致甲醇中毒的病例常發(fā)生,患者急性期主要表現(xiàn)為肝臟損傷,愈后常遺留不同程度的視力障礙[1-3]。有關(guān)甲醇中毒的研究并不少見,但多僅限于臨床病例報(bào)道[4-5],而對(duì)甲醇引起的肝細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué),特別是超微結(jié)構(gòu)變化的中毒病理學(xué)研究報(bào)道尚少。本研究選用SD大鼠,用甲醇和乙醇的不同比例混合液模擬假酒灌胃,建立假酒中毒動(dòng)物模型,觀察甲醇中毒引起的肝細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化,探討甲醇所致肝臟功能障礙和視力損害的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),為有效治療甲醇中毒提供理論依據(jù)。
健康雄性SD大鼠16只,用隨機(jī)數(shù)排序法分為4組,每組4只。即甲醇組,被給于25%甲醇蒸餾水;甲醇、乙醇混合組,被給于25%甲醇生理鹽水與25%乙醇蒸餾水等量混合液;乙醇組,被給于25%乙醇蒸餾水;對(duì)照組,被給于蒸餾水。將首次灌胃的時(shí)間被定為0 h,分別在灌胃后的第10 h、24 h、48 h對(duì)各組大鼠再進(jìn)行灌胃。甲醇組:首次甲醇灌胃劑量為2 g/kg,其后每次1 g/kg;甲醇、乙醇混合組:以甲醇計(jì)量,首次劑量1 g/kg,其后每次0.5 g/kg;乙醇組:乙醇灌胃劑量為2 g/kg,其后每次1 g/kg;對(duì)照組:與實(shí)驗(yàn)組等劑量蒸餾水灌胃,首次氯化鈉劑量為8 g/kg,其后每次4 g/kg。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前先行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)熟練技術(shù)方法和確定試藥劑量,以盡可能減小實(shí)驗(yàn)技術(shù)造成的組間誤差。
1.2.1 動(dòng)物模型建立:以大鼠對(duì)光刺激的反應(yīng)速度作為評(píng)價(jià)模型是否成功建立的依據(jù)。正常大鼠對(duì)迎面光照刺激反應(yīng)敏感且迅速,而染毒大鼠對(duì)同樣光刺激的反應(yīng)遲鈍甚至消失。
1.2.2 全身及眼、肝臟中毒表現(xiàn):通過(guò)觀察和記錄藥物灌胃后大鼠的反應(yīng)速度、活動(dòng)、意識(shí)狀態(tài)及對(duì)光刺激的反應(yīng)變化確定大鼠是否中毒。
1.2.3 染毒大鼠肝細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察:灌胃48 h 脫臼法處死大鼠,迅速摘除肝臟及雙側(cè)眼球,分離切取1 mm×5 mm大小肝和視網(wǎng)膜組織,PBS沖洗后2.5%戊二醛固定,4 ℃冰箱過(guò)夜。次日,1%四氧化鋨后固定2 h,丙酮系列脫水,定向包埋,半薄切片顯微鏡下定位,并制成超薄切片。以醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色,透射電鏡下觀察肝細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
對(duì)照組動(dòng)物毛色光亮,反應(yīng)如常,眼、鼻處肉眼觀均無(wú)異常。與對(duì)照組相比,甲醇組動(dòng)物毛色灰暗,活動(dòng)減少,反應(yīng)呆滯,對(duì)光刺激的反應(yīng)明顯減弱,結(jié)膜出血、鼻孔出血,并伴有運(yùn)動(dòng)失調(diào);甲醇、乙醇混合組動(dòng)物毛逆、成團(tuán)、欠規(guī)則,反應(yīng)遲鈍,對(duì)光刺激無(wú)強(qiáng)烈反應(yīng),結(jié)膜充血,鼻孔出血,運(yùn)動(dòng)不靈活。上述兩實(shí)驗(yàn)組大鼠的異常變化在第1次灌胃后開始出現(xiàn),且隨灌胃次數(shù)增加不斷加重,且相鄰兩次灌胃之間癥狀不緩解。乙醇組動(dòng)物毛色一般,反應(yīng)遲鈍,對(duì)光刺激反應(yīng)較弱,眼部結(jié)膜無(wú)明顯充血或出血,鼻孔無(wú)出血,每次灌胃后上述反應(yīng)加重,但在相鄰兩次灌胃之間癥狀緩解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),甲醇組及甲醇、乙醇混合組動(dòng)物的體質(zhì)明顯減弱,而乙醇組動(dòng)物則略虛弱于對(duì)照組。
2.2.1 肝組織的改變:對(duì)照組動(dòng)物肝細(xì)胞線粒體排列有序,大小一致,多數(shù)呈球形,電子密度較大,可見嵴結(jié)構(gòu);粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊、核糖體顆粒豐富(圖1a)。與對(duì)照組相比,乙醇組動(dòng)物肝細(xì)胞線粒體體積大小不等,形態(tài)略不規(guī)則,電子密度明顯降低,部分基質(zhì)溶解、部分嵴結(jié)構(gòu)消失;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少,并擴(kuò)張、膨脹、膜融合,核糖體脫落并與病態(tài)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)混合于胞質(zhì)中(圖1b)。甲醇組動(dòng)物肝細(xì)胞線粒體的形狀不規(guī)則和大小不等,電子密度降低,雙層膜和嵴結(jié)構(gòu)均模糊不清;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少、并有脫顆?,F(xiàn)象,高度囊性變與少量核糖體顆?;烊苄纬砂|(zhì)的溶解區(qū)(圖1c);甲醇、乙醇混合組動(dòng)物線粒體極度腫脹、幾呈空泡狀,大小、形狀沒有規(guī)則,雙層膜結(jié)構(gòu)幾乎消失,電子密度很低,絕大多數(shù)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失與極少量核糖體混合為形狀及分布均不規(guī)則的大片溶解區(qū)(圖1d)。
2.2.2 視網(wǎng)膜組織(視錐視桿層細(xì)胞外節(jié)膜盤)的改變:對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜外核層感光細(xì)胞外節(jié)內(nèi)膜盤(即光感受器)呈規(guī)則、有序板層排列,膜盤界限分明(圖2a);乙醇組動(dòng)物視網(wǎng)膜膜盤結(jié)構(gòu)仍清晰、規(guī)則,部分區(qū)域排列略疏松,磨盤之間分界明顯(圖2b);甲醇組動(dòng)物視網(wǎng)膜膜盤感光細(xì)胞排列不規(guī)則,膜盤間縫隙增大,并失去正常板層結(jié)構(gòu),同時(shí)可見空泡樣改變,局部出現(xiàn)膜盤溶解、相互融合、分辨不清(圖2c);甲醇、乙醇混合組動(dòng)物視網(wǎng)膜外節(jié)膜盤排列無(wú)規(guī)則,膜盤縫隙明顯增大,有明顯的空泡樣改變,局部區(qū)域膜盤徹底失去板層樣結(jié)構(gòu)而呈紊亂排列的髓樣結(jié)構(gòu),磨盤失去界限,相互融合(圖2d)。
圖1 各組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)局部超微結(jié)構(gòu) ×6500Fig 1 Cytoplasm ultrastructure of liver cells in each group ×6500
圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜視錐視桿層膜盤超微結(jié)構(gòu) ×6500Fig 2 Ultrastructure of retinal cone-rod layer membrane discs in each group ×6500
人類急、慢性甲醇中毒的主要臨床表現(xiàn)為肝臟功能的衰竭、眼部的損害和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。臨床上,以甲醇攝入史、血液甲醇濃度異常、肝臟、眼部和神經(jīng)系統(tǒng)損害的癥狀為診斷依據(jù);體征如頭痛、意識(shí)功能障礙、感覺障礙、視物不清、視野縮小、視網(wǎng)膜電圖和視覺誘發(fā)電位異常等[4-5]。本實(shí)驗(yàn)主要采用灌胃的方式模擬甲醇經(jīng)口進(jìn)入的過(guò)程,建立了大鼠甲醇中毒動(dòng)物模型,并借鑒臨床對(duì)患者觀察和診斷的一些方法,觀察了染毒動(dòng)物的體表和行為變化。發(fā)現(xiàn)動(dòng)物模型中大鼠染毒后的出現(xiàn)的體表改變和行為變化與甲醇中毒患者相似,提示大鼠已發(fā)生了甲醇中毒。
電鏡下,甲醇染毒或甲、乙醇混合染毒大鼠肝細(xì)胞的線粒體腫脹,雙層膜的原有結(jié)構(gòu)發(fā)生模糊,同時(shí)有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的退化、擴(kuò)張、溶解、脫顆粒等。肝臟是人體物質(zhì)代謝的重要器官,其解毒、合成作用強(qiáng)大,且不可或缺[6]。肝臟功能的完成依賴于完整的細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的存在,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在其中起到了重要作用。因而甲醇對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的破壞作用必然影響肝臟的解毒過(guò)程以及各種物質(zhì)的合成;線粒體的損害則影響到了肝組織的能量供應(yīng),必然會(huì)使肝組織的代謝水平顯著下降。值得注意的是,同時(shí)染毒甲醇和乙醇動(dòng)物的肝細(xì)胞的上述損害更為顯著。假酒多由甲醇與乙醇勾兌而成,其對(duì)人體肝臟的傷害可能重于單一甲醇。
甲醇對(duì)眼部損害主要體現(xiàn)在眼底的異常改變和結(jié)膜充血或出血。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)感光細(xì)胞的光感受器(膜盤)有明顯的損傷作用。這種損傷使光刺激傳遞通路從初始點(diǎn)就出現(xiàn)了功能障礙,嚴(yán)重影響視網(wǎng)膜視覺信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生[7],這可能是甲醇中毒引起視覺障礙的原因之一。
視網(wǎng)膜各層,尤其是光感受器內(nèi)的生化代謝極為活躍,是體內(nèi)耗氧量較高的器官之一,而線粒體則是細(xì)胞內(nèi)提供能量的主要裝置。若線粒體電子傳遞及氧化磷酸化受阻,將導(dǎo)致細(xì)胞離子泵功能障礙,各層組織以及細(xì)胞器的水腫和病態(tài)膨脹,從而影響細(xì)胞功能。甲醇對(duì)視力的損傷可能與其對(duì)線粒體的損傷作用有關(guān)。
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