潘晶晶， 馮繼鋒

表皮生長因子受體(EGFR)信號通路參與控制細胞的存活、增殖、血管生成、細胞遷移、細胞侵襲及轉(zhuǎn)移等過程［1］，因此通過干預EGFR酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導已成為近年來腫瘤治療的研究熱點。EGFR特異性小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼和厄洛替尼是治療非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)的小分子靶向藥物。2004年，多個權(quán)威期刊發(fā)表了關于EGFR突變與 TKI藥物敏感性關系的研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變的患者對TKI藥物有很好的反應性［2-3］，特別是具有19外顯子密碼子746～750的缺失突變，21外顯子密碼子858替代突變(L858)的患者對TKI高度敏感。盡管如此，原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥仍是亟待解決的問題。到目前為止，很多關于耐藥的機制被報道，如EGFR基因20外顯子的插入突變及KRAS基因突變與原發(fā)性耐藥有關;EGFR基因的二次突變，MET基因的擴增以及HGF基因的過表達與繼發(fā)性耐藥有關等。本文就EGFR靶向治療藥物的臨床應用，耐藥機制及相關解決方法進行綜述。

1 EGFR-TKI在NSCLC臨床治療中的應用

EGFR-TKI通過與細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域上ATP位點競爭性結(jié)合，可逆性、選擇性抑制與EGFR相關的酪氨酸激酶活性及細胞內(nèi)磷酸化過程，進而抑制EGFR下游的信號轉(zhuǎn)導，從而阻斷EGFR誘導的體外腫瘤細胞的生長，加速細胞凋亡、拮抗血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、阻斷腫瘤生長。

1.1 吉非替尼

吉非替尼是最早用于治療NSCLC的靶向藥物之一，已有多項國際多中心臨床研究證實吉非替尼治療肺腺癌有效。IPASS研究是在東亞，對非吸煙或很少吸煙的患者進行吉非替尼與卡鉑+紫杉醇聯(lián)合化療的對照實驗，結(jié)果顯示在所有患者中吉非替尼組比卡鉑－紫杉醇組有更長的無疾病進展(PFS)，在EGFR突變的患者中吉非替尼組的PFS更是明顯長于聯(lián)合化療組(9.5個月 vs.6.6個月)［4］。IDEAL-1及IDEAL-2為兩項多中心Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果也均顯示吉非替尼對復治的進展期NSCLC患者具有令人鼓舞的抗腫瘤活性和耐受性［5-6］。但基于吉非替尼與細胞毒藥物化療的協(xié)同作用研究結(jié)果則不滿意，一項Ⅲ期臨床試驗INTACT-1，在GP方案中加入吉非替尼卻未顯示出任何獲益。另一項Ⅲ期臨床研究INTACT-2則對吉非替尼聯(lián)合TC作為晚期NSCLC一線治療方案作了評價，顯示在化療的基礎上加用吉非替尼，OS、RR及無病生存期(DFS)也無明顯改善［7］。值得注意的是，在 INTACT試驗中的312例患者中有32例(10%)被檢測出有EGFR突變，而依據(jù)EGFR基因型判斷對吉非替尼聯(lián)合化療的反應雖無明顯的統(tǒng)計學意義，但EGFR突變的NSCLC患者應用吉非替尼后生存率卻顯著提高。

1.2 厄洛替尼

厄洛替尼是一種可逆的ATP競爭性EGFRTKI，通過抑制EGFR自身磷酸化而抑制下游信號傳導與細胞增殖。Ⅲ期臨床研究BR.21試驗結(jié)果顯示，與安慰劑相比，口服厄羅替尼150mg/d可顯著延長晚期NSCLC患者生存期，改善生活質(zhì)量［8］。在2009年ASCO年會上，來自西班牙的數(shù)據(jù)也提示厄羅替尼單藥治療晚期EGFR突變的NSCLC患者，中位疾病進展時間(TTP)達到14個月，中位生存期為27個月，明顯優(yōu)于標準一線化療方案。

1.3 其他

不可逆的EGFR抑制劑包括 BIBW2992、BMS-690514、PF-00299804和EKB-569等，它們的療效尚待評估［9］。還有針對多靶點信號通路的藥物，如ZD6474(vandetanib)和BMS-690514，目前也都處于臨床試驗階段。

2 EGFR突變與TKI敏感性的關系

EGFR的激活性突變集中在四個密碼子(18～21)，分別為外顯子18的單堿基替代、外顯子19的缺失、外顯子20的插入/重迭及外顯子21的單堿基替代L858R的點突變。其中19外顯子的缺失突變和21外顯子的點突變占所有突變的90%［10-11］。在所有突變中，G719C(外顯子18)、E746-A750(外顯子19)、R776C(外顯子20)及L858R(外顯子21)的突變與TKI敏感性有關。上述突變陽性者對EGFRTKI的有效率為50% ～80%，而野生型患者的有效率僅為10% ～15%。相關研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變在亞洲人、女性、非吸煙及腺癌患者中常見，而突變患者對吉非替尼和厄洛替尼高度敏感，但TKI并非對所有EGFR基因突變的肺癌患者有效，一些基因突變患者并不能從TKI治療中獲益，同時約18%的EGFR未突變的患者卻對TKI存在部分反應性［12］。

3 EGFR-TKI的耐藥機制

3.1 原發(fā)性耐藥機制

原發(fā)性耐藥是指首次使用TKI治療即產(chǎn)生的耐藥，約有60%的肺癌患者為TKI原發(fā)性耐藥。目前認為，KRAS突變和EGFR外顯子20的插入突變與TKI的原發(fā)性耐藥相關［13-14］。Pao 等［15］共收集了60例首次TKI單藥化療的肺腺癌患者，有38例對TKI不敏感，其中9例存在KRAS的基因突變;而在客觀緩解的21例患者中均無KRAS突變。由此推斷KRAS基因突變與肺腺癌患者對TKI的原發(fā)耐藥密切相關。Eberhand等［16］也發(fā)現(xiàn)具有KRAS突變的患者不僅沒有從厄洛替尼與化療聯(lián)合應用中獲益，而且與單純接受化療的患者相比預后更差。需要注意的是，KRAS突變與EGFR突變是不共存的，因此對沒有EGFR突變的患者是否選擇TKI治療主要應參考KRAS基因的突變情況。

3.2 獲得性耐藥機制

獲得性耐藥的確切機制目前仍不清楚。目前幾個潛在的假說有:二次突變學說，Met受體酪氨酸激酶基因擴增學說及其他受體酪氨酸激酶的過度表達學說［17-18］。

3.2.1 二次突變學說 T790M的二次突變最普遍，在約50%的TKI耐藥患者中出現(xiàn)，其他位點的二次突變相對少見。(1)T790M突變:EGFR基因外顯子20在TKI治療過程中出現(xiàn)二次突變，導致EGFR 790位點上的蘇氨酸(threonine)被甲硫氨酸(methionine)取代，結(jié)果在該位點上引入了一條較大的氨基酸側(cè)鏈，構(gòu)成空間位阻，因此阻止 TKI和EGFR-TK催化域中的Mg-ATP位點的競爭性結(jié)合，而ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合未受影響，激酶繼續(xù)得以磷酸化［19］。Bell等［20］對一個肺癌家系的研究提示T790M并非致癌性突變，其在早期可能以微小克隆形式存在于癌組織中，隨著敏感克隆被TKI清除通過自然選擇的作用而被保留下來并進一步擴增凸顯，在腫瘤發(fā)展的繼承階段起重要作用。為進一步證實T790M并非原發(fā)突變，Toyooka等［21］的研究證實在未接受TKI治療的患者中僅有0.5%可檢測出T790M突變。Onitsuka等［22］也進行過類似的研究，發(fā)現(xiàn)在10個吉非替尼繼發(fā)耐藥的患者中有7個檢測出T790M突變。(2)非T790M突變:與T790M突變相類似的耐藥突變還有D761Y、L858R、L747S、E884K及G796A等突變，他們的總發(fā)生率低于5%。第一個被發(fā)現(xiàn)的非T790M突變的是D761Y，通常與L858R突變并存的，兩位點同時突變與L858R突變相比更容易對吉非替尼耐藥，但與T790M突變相比，耐藥可能性要小很多［23］。L747S、L858R 同時突變也比單純L858突變在體外對吉非替尼和厄洛替尼更容易耐藥。一項關于L858R、L747S和L858R、D761Y突變的體外臨床試驗顯示當吉非替尼和厄洛替尼達到1uM時可以阻止這些突變，說明可以通過TKI的劑量轉(zhuǎn)換即能解決對吉非替尼的耐藥［24］。Choong等［25］報道了1例從未吸煙的70歲肺腺癌的日裔女性，接受EGFR-TKIs治療失敗后檢測發(fā)現(xiàn)了E884K和L858R體細胞突變，提示這兩種突變類型可能參與 TKI耐藥的發(fā)生。Uramoto等［26］報道EGFR外顯子20的G796A突變也可能參與了吉非替尼耐藥的發(fā)生。

3.2.2 c-MET 擴增學說 2007年，Dana-Farber腫瘤研究中心報道MET基因的擴增與吉非替尼的獲得性耐藥有關。研究顯示，MET是肝細胞生長因子(HGF)的受體，編碼HGF酪氨酸激酶受體的跨膜區(qū)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和擴增有關。MET基因的擴增在未治療的NSCLC中很少見，但是在對TKI獲得性耐藥的細胞中發(fā)現(xiàn)MET基因的擴增，從而提示其與另一種新的耐藥機制有關［27］。Engelman等［18］在18例已被吉非替尼誘導耐藥的肺癌細胞株中檢測出4例MET基因擴增，結(jié)果顯示MET基因擴增可誘導 HER3(ErbB3)磷酸化，使 PI3K/Akt通路持續(xù)活化，從而導致吉非替尼繼發(fā)耐藥的發(fā)生。

3.2.3 肝細胞生長因子過表達學說 2008年，日本的一家研究機構(gòu)報道肝細胞生長因子(HGF)的過表達與EGFR-TKI的耐藥有關。HGF通過MET的磷酸化降低了PI3K/AKT通路的恢復。盡管MET基因擴增激活了與ErbB3有關的下游通路，HGF通過MET降低了下游通路的活性，這種激活不依賴ErbB3或者EGFR。研究發(fā)現(xiàn)HGF的過表達不僅存在于沒有T790M突變或MET基因擴增的耐藥的腫瘤中，還在沒有EGFR敏感性突變的原發(fā)性耐藥腫瘤中存在［28］。Turke等［29］等通過檢測27 例腫瘤組織，通過對比用藥前與用藥后的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)其中有16例在經(jīng)過TKI治療后出現(xiàn)HGF的顯著增高。Guix等［30］還發(fā)現(xiàn)HGF通過選擇性擴增MET基因過表達的克隆從而發(fā)揮耐藥作用。盡管目前在獲得性耐藥的腫瘤中HGF出現(xiàn)的頻率尚不清楚，但是HGF與T790M突變共存的現(xiàn)象比較多。Yamada等［31］報道HGF的過表達不僅與可逆性EGFR-TKI耐藥有關，還與不可逆性EGFR-TKI耐藥有關。

3.2.4 其他學說 由于ErbB3介導的P13K信號通路的持續(xù)激活和TKI耐藥相關，反之猜測P13K信號通路抑制成分的缺失在耐藥發(fā)生中舉足輕重;此外，通過mTOR-IGFIR起作用的信號通路也會使EGFR靶向治療有效的病例復發(fā)。由此，學者還提出了其他的耐藥機制，如細胞的程序性死亡，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化及10號染色體q23D的缺失等。

4 耐藥逆轉(zhuǎn)的方法

4.1 不可逆性EGFR-TKI

吉非替尼和厄洛替尼都是可逆性EGFR-TKI，也被稱為第一代EGFR-TKI，目前在研究中的第二代EGFR-TKI大多為不可逆的EGFR-TKI。通過共價結(jié)合于EGFR催化域ATP結(jié)合位點邊緣的cys-797，從而使藥物濃度大幅升高并提供持續(xù)的封鎖效應，因此能進一步增強對腫瘤細胞的抑制。目前進入臨床試驗的有同時抑制EGFR及HER2的雙重抑制劑 HKI-272［31］及 BIBW2992［32］，以及同時抑制EGFR，HER2和 HER4的三重抑制劑 PF-00299804［33］。體外研究表明 HKI-272對含有雙突變(對TKI敏感的突變?nèi)鏓GFR外顯子19缺失突變和外顯子21的L858R點突變及T790M突變)的肺癌細胞系有效，但不能完全阻斷T790M突變的信號傳導。臨床前試驗發(fā)現(xiàn)BIBW2992對有繼發(fā)性耐藥突變T790M的腫瘤細胞有活性，盡管不可逆性EGFR-TKI能有效抑制含有T790M突變的腫瘤細胞，但是含有EGFR T790M擴增的克隆無論是在體內(nèi)還是體外都迅速融合，從而導致對不可逆性EGFR-TKI耐藥。

4.2 MET抑制劑及HGF抑制劑

一項臨床前研究顯示了MET及HGF抑制劑的有效性，抑制MET基因擴增的抑制劑PHA-665752及抑制HGF過表達的抑制劑PF2341066都被證實有臨床療效［34］。MET基因的擴增與HGF的過表達通常是與T790M突變共存的，因此，要解決耐藥問題，聯(lián)合使用不可逆性EGFR-TKI及MET抑制劑正在臨床研究中。

4.3 p53 抑制劑

大多對吉非替尼有效的患者存在EGFR突變，但并不是所有EGFR突變患者對EGFR-TKI有效，而一些沒有EGFR突變的患者又能獲得療效，這表明還存在決定患者對吉非替尼敏感性的其他因素。腫瘤抑制基因p53能通過調(diào)節(jié)NSCLC中的Fas促進吉非替尼誘導的生長抑制和凋亡，p53的突變常與藥物耐藥相關。Jin等［35］將吉非替尼用于人NSCLC株NCI-H1299和A549，這兩種細胞株均沒有EGFR-TK突變，研究發(fā)現(xiàn)NCI-H1299(存在p53無效基因型)比A549細胞株(存在野生型p53)對吉非替尼更為耐藥(NCI-H1299 IC50為40 μmol/L，A549 IC50為5 μmol/L)。在穩(wěn)定的 H1299細胞株中，有四環(huán)素誘導的p53表達，被誘導的p53通過上調(diào)Fas和恢復半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)活性，能促進吉非替尼誘導的生長抑制和凋亡。相反，同等條件下使用反義寡聚核苷酸的p53抑制劑，在A549細胞株中能使吉非替尼誘導的凋亡明顯降低，同時Fas下調(diào)。因此，p53可能通過調(diào)節(jié)NSCLC中的Fas表達以確定腫瘤細胞對吉非替尼的敏感性。

綜上所述，分子靶向治療對腫瘤治療具有劃時代的意義，從基因?qū)W角度尋找合適的患者，能達到最好的治療效果。耐藥現(xiàn)象不可避免地發(fā)生為靶向治療進一步的應用帶來問題，對于耐藥機制的研究可以幫助人們尋找到能夠預測療效和指導治療策略的分子標志物，使得靶向藥物的治療效果進一步提高。

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