紀樹武 毛小東 劉菊梅 陳海泉 袁 平 房志鵬 徐 峰

（1 上海市第七人民醫(yī)院胸外科，上海 200137；2 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，上海 200032；3 美國安德森癌癥研究中心，休斯敦77030）

食管癌腫瘤組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性

紀樹武1毛小東1劉菊梅1陳海泉2袁 平3房志鵬1徐 峰1

（1 上海市第七人民醫(yī)院胸外科，上海 200137；2 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，上海 200032；3 美國安德森癌癥研究中心，休斯敦77030）

目的 研究食管癌患者腫瘤組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因多態(tài)性，探討該基因與食管癌之間的關(guān)系。方法 共檢測50例食管癌患者組織標本，利用聚合酶鏈反應（PCR）檢測ACE基因，觀察插入型（ID型）、缺失型（DD型）和Ⅱ型3種基因型多態(tài)性分布，并計算I/D等位基因的比例，以10例癌旁正常組織為對照。結(jié)果 食管癌患者腫瘤組織中ACE基因插入/缺失（I/D）多態(tài)性分布特點：ID型、DD型和Ⅱ型基因比例分別為16%，64%，20%，而I/D等位基因分布頻率分別為20%和80%，對照組ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型的比例分別為40%、30%、30%，其I/D等位基因分布頻率分別為30%和70%，兩組間DD型基因分布頻率有統(tǒng)計學顯著性差異（P＜0.05）、I/D等位基因分布頻率無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 食管癌患者腫瘤組織中存在ACE基因I/D多態(tài)性，DD型基因分布較癌旁正常組織顯著升高，結(jié)果表明DD基因型高表達可能與食管癌發(fā)病相關(guān)。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶；基因；多態(tài)性；食管癌

食管癌是危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE）與消化道腫瘤存在一定關(guān)系[2]。胡艷等研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者ACE基因中的II型基因高表達可能與結(jié)腸癌發(fā)病存在一定相關(guān)[3]。但迄今，有關(guān)ACE基因與食管癌發(fā)病之間的關(guān)系尚不明確，為此，我們開展了本研究，通過檢測50例食管癌患者切除的腫瘤組織中ACE基因多態(tài)性，以了解該基因ID型、DD型和Ⅱ型3種基因型在食管癌中的分布頻率，以該組病例部分癌旁正常組織作為對照，探討ACE基因插入（insertion，I） /缺失（deletion，D）多態(tài)性與食管癌發(fā)病之間的關(guān)系，現(xiàn)將我們的研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 入選病例

選取本院2008年1月至2010年6月住院食管癌患者50例。入選標準：①臨床確診食管癌患者；②全部病例均取得病理報告證實；③年齡20～70周歲；Karnofsky評分＞70分； 排除標準：①不符合食管癌診斷標準者；②未取得病理報告證實者；③年齡不符者；④原發(fā)性高血壓病患者；⑤不愿意接受本研究措施者。

1.2 患者情況

研究組共50例，年齡40～70周歲，其中男性27例，女性23例，平均年齡62.9±9.8歲，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期者19例，Ⅲ-Ⅳ期者31例，從研究組中隨機抽取10例癌旁正常組織作為對照，經(jīng)統(tǒng)計學處理，兩組在年齡、性別、家族史、吸煙史等方面均無顯著差異（P＞0.05）。

1.3 DNA提取、引物合成和PCR擴增

采用蛋白酶K消化酚－氯仿抽提法，按參考文獻[4]進行。引物由上海生工合成，序列如下：

ACE-1-上游: 5'-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3'

ACE-1-下游: 5'-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3'

插入型擴增片段大小為597bp，缺失型為319bp。其PCR擴增體系：體積為25μL，反應體系含Taq酶1.0μL，10×buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，引物（10pmol/μL）各0.5μL，模板gDNA約100ng。擴增條件為：94℃預變性5min，然后94℃30S，56℃45s，72℃1min，共35個循環(huán)；最后72℃ 5min。試劑購自Takara公司。為保證結(jié)果的真實可靠，對于基因型為DD型的標本再用特異性擴增插入片段的ACE-2進行驗證，如擴增出目的片段則為ID型。ACE-2引物序列如下所示：

ACE-2-上游：5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3'

ACE-2-下游：5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3'

擴增片段大小為335bp，退火溫度為65℃，其反應條件同ACE-1。

1.4 PCR產(chǎn)物的鑒定檢測

所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳約30min，電壓100v，在紫外燈下觀察條帶。所用Marker為DL2000。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包，組間頻率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 食管癌患者PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，見圖1、圖2。

圖1 食管癌患者ACE-1擴增后產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 癌旁正常組織ACE-1擴增后的電泳結(jié)果

其中圖1為食管癌組織部分電泳結(jié)果，1，5，6，9，11號標本為DD型；4，7，8，10，12，13號標本為ID型；2，3，14，15號標本為Ⅱ型。圖2為癌旁正常對照組電泳結(jié)果，3，5，10號標本為DD型；1，4，6，7號標本為ID型；2，8，9號標本為Ⅱ型。

2.2 食管癌ACE基因型結(jié)果分析

DD型在ACE-1擴增后僅有一條319片段條帶，有一條579片段條帶的則為II型，同時見上述兩種條帶的則為ID型。ACE-2擴增主要是防止和糾正優(yōu)勢片段擴增，防止結(jié)果誤判。結(jié)果，在50例食管癌患者組織標本中，缺失純合子型（DD型）有32例，比例為64%（32/50）；有8例標本為缺失雜合子型（ID型），比例為16%（8/50）；插入純合子型（II型）共10例，比例20%（10/50）；共檢測10例癌旁正常組織，測得結(jié)果為DD型、ID型、II型分別占30%（3/10）、40%（4/10）和30%（3/10），經(jīng)統(tǒng)計分析，兩組在DD型基因的分布頻率上有顯著差異（χ2= 3.963，P＜0.05）。見表1，對等位基因進行分析，結(jié)果無顯著差異（χ2=0.491，P＞0.05），見表2。

表1 食管癌患者腫瘤組織ACE基因多態(tài)性檢測結(jié)果

表2 食管癌患者腫瘤組織ACE等位基因檢測結(jié)果

3 討 論

ACE基因位于17號染色體長臂q23位點，由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，其16內(nèi)含子存在一段287bp的DNA序列的插入（I）或缺失（D），由此構(gòu)成ACE基因I/D多態(tài)性并分出基因型三種：即ID型（缺失與插入純合子）、DD型（缺失純合子）、Ⅱ型（插入純合子）。多年來，ACE基因一直是高血壓病和腎病等的熱點基因。文獻提示ACE抑制劑顯著降低結(jié)腸癌風險[5]。周莉等研究ACE與結(jié)腸癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ACE多態(tài)性與結(jié)腸癌發(fā)病可能相關(guān)[6]，而ACE多態(tài)性與食管癌關(guān)系如何，相關(guān)報道較少。

近幾年來ACE基因與腫瘤發(fā)病關(guān)系的研究漸熱。Attoub及Herr等的研究發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)性與乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的發(fā)病相關(guān)[7-9]。文獻報道缺失型片段存在優(yōu)勢擴增，故DD型通常需要用擴增插入片段的特異性引物進行擴增后驗證，而我們在實驗過程中也確有發(fā)現(xiàn)某些ID基因型的樣本亦表現(xiàn)為插入片段優(yōu)勢擴增，提示我們在進行相關(guān)研究時須注意優(yōu)勢擴增和錯配的問題。

在本研究中，共選取了食管癌患者50例，檢測腫瘤組織中ACE基因多態(tài)性及I/D等位基因，探索其與食管癌發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果表明食管癌患者腫瘤組織中ACE基因ID型、DD型及Ⅱ型基因分布頻率較癌旁正常組織有顯著性差異，其中DD型基因頻率顯著高于對照（P＜0.05），這與我們從外周血中得到的結(jié)果是一致的，說明ACE基因的缺失多態(tài)性有可能是食管癌發(fā)病的重要遺傳因素之一，本研究呼應了Vairaktaris等的研究結(jié)果，說明ACE基因與食管癌在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)。

總之，本研究初步證明食管癌發(fā)病與ACE基因的多態(tài)性分布相關(guān)，其中DD基因型高表達可能是食管癌易患因素之一，但本研究的不足之處也是存在的：由于條件限制，所獲樣本數(shù)量較少，所獲得的結(jié)果尚需更多更加深入的研究加以證實，而這也是我們下一步努力的方向之一。

[1] Li YF,Hu Y,Lin P,et al.Significance of subcarinal lymph node selective dissection in thoracic esophageal carcinoma[J].Chin Med J,2010,90(37):2636-2639.

[2] Rocken C,Rohl FW,Diebler E,et al.The angiotensin II/angiotensin II receptor system correlates with nodal spread in intestinal type gastric cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(6):1206-1212.

[3] 胡艷,侯安繼,張紅衛(wèi),等.結(jié)腸癌患者腫瘤組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性研究[J].腫瘤雜志,2010,30(3):265-266.

[4] Zhao L,Wang,L,Ji W,et al.Association between plasma angiotensinconverting enzyme level and radiation pneumonitis[J].Cytokine,2007,37(1):71-75.

[5] Neo JH,Malcontenti-Wilson C,Muralidharan V,et al.Effect of ACE inhibitors and angiotensin II receptor antagonists in a mouse model of colorectal cancer liver metastases[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(4):577-584.

[6] 周莉,胡艷,張紅衛(wèi),等.結(jié)腸癌患者外周血血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性[J].腫瘤防治研究,2010,37(9):1040-1043.

[7] Herr D,Rodewald M,Fraser HM,et al.Potential role of Renin-Angiotensin-system for tumor angiogenesis in receptor negative breast cancer[J].Gynecol Oncol,2008,109(3):418-425.

[8] Yaren A,Oztop I,Turgut S,et al.Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism is associated with anemia in non small-cell lung cancer[J].Exp Biol Med (Maywood),2008,233(1):32-37.

[9] Sugimoto M,Furuta T,Shirai N,et al.Influences of chymase and angiotensin I-converting enzyme gene polymorphisms on gastric cancer risks in Japan[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15(10):1929-1934.

The Polymorphism of Angiotensin Ⅰ-converting Enzyme Gene in Tumor Tissue of Esophageal Carcinoma Patients

JI Shu-wu1, MAO Xiaod-ong1, LIU Ju-mei1, CHEN Hai-quan2, YUAN Ping3, FANG Zhi-peng1, XU Feng1
(1 Department of Thoracic Surgery, Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China;2 Department of Thoracic Surgery, Fudan University Affliated Cancer Hospital, Shanghai 200032, China;3 United States Anderson Cancer Center，Houston 77030，USA)

ObjectiveThe present study was assigned to investigate the correlation between the insertion/deletion (I/D) polymorphism of angiotensinⅠ-converting enzyme gene (ACE) and esophageal carcinoma.Methods50 patients were enrolled in the study.Polymerase chain reaction (PCR) was served to detect insertion/deletion genotypes of ACE gene in tumor tissues and ACE expression in 10 samples of normal tissue in the same group were served as control.ResultsIn tumor tissue of esophageal carcinoma, the frequencies of genotypes of ID, DD and Ⅱ of ACE gene were 16%, 64% and 20%respectively, the I/D alleles were 20% and 80% respectively; in the control, the frequencies of genotypes of ID, DD and Ⅱ of ACE gene were 40%, 30%,30% respectively, I/D alleles were 30% and 70% respectively, the difference of DD genotype between two groups was signi fi cant (P＜0.05), however, the difference of I/D alleles was not signi fi cant(P＞0.05).ConclusionsThere was an (I/D) polymorphism of ACE gene in esophageal carcinoma patients, the different polymorphism of ACE gene might be correlated to the incidence of the disease.

Angiotensin Ⅰ-converting enzyme; Gene; Polymorphism; Esophageal carcinoma

R735.1

B

1671-8194（2012）16-0001-02

10.15912/j.cnki.gocm.2012.16.281

上海市浦東新區(qū)科技基金項目(編號:PW2009A-19)