黎進(jìn)平

四川省攀枝花市食品藥品檢驗所，四川攀枝花 617000

常規(guī)HPLC法檢驗中藥常見問題的探討

黎進(jìn)平

四川省攀枝花市食品藥品檢驗所，四川攀枝花 617000

目的 探討常規(guī)高效液相色譜（HPLC）法（ODS柱，紫外檢測器）檢驗中藥中遇到的常見問題。 方法 結(jié)合筆者近幾年檢驗工作的實踐和經(jīng)驗來展開分析討論。 結(jié)果 提出了解決常見問題的方法和對策。 結(jié)論 具體問題要具體分析，合理調(diào)整可變的檢驗條件是解決問題的重要途徑。

中藥；HPLC；藥品檢驗

高效液相色譜（HPLC）法是一種同時具有分離、分析功能和快速、高效、靈敏等優(yōu)點的檢測技術(shù)，現(xiàn)已成為藥品分離、鑒定和含量測定的首選方法[1]。運(yùn)用HPLC法進(jìn)行中藥檢驗時，最常規(guī)的檢測條件是十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）為填充劑的色譜柱和紫外檢測器[2]。在《中國藥典》一部中，很多品種也都采用了常規(guī)HPLC法來檢驗。筆者就自己在運(yùn)用該法檢驗中藥時遇到的幾個常見問題，結(jié)合工作實踐，談?wù)勛约旱目捶?，希望能對中藥檢驗工作者，特別是接觸檢驗工作不久的人員提供參考和幫助，以便在遇到類似問題時，容易找到解決的思路和方向，使問題能及時準(zhǔn)確地處理，也為檢驗工作的順利推進(jìn)起到積極作用。

1 對照品峰被分成2個的問題

常規(guī)HPLC法檢驗中藥中，單一的對照品應(yīng)該只出1個峰，但有時會出現(xiàn)對照品峰被分成2個的情況，如果遇到這樣的問題，筆者認(rèn)為，不要急于更換色譜柱或調(diào)整流動相，可以先考慮減少進(jìn)樣量再進(jìn)1針，有可能是樣量過載。比如筆者在做刺五加片[3]489（多多藥業(yè)有限公司，批號：1005091）的含量測定時，設(shè)定的檢驗條件：Kromasil 100-5 C18柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標(biāo)準(zhǔn)相同，流速0.95 mL/min，進(jìn)樣10 μL，對照品紫丁香苷峰被分成2個，小峰在左側(cè)。在其他條件不變的情況下，將進(jìn)樣量改進(jìn)5 μL，則峰型正常；在做九味羌活顆粒[4]449（九寨溝天然藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號：110302）的含量測定時，設(shè)定檢驗條件Kromasil 100-5 C18柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標(biāo)準(zhǔn)相同，流速1.00 mL/min，進(jìn)樣20 μL，對照品黃芩苷峰被分成2個，小峰在左側(cè)，同樣只將進(jìn)樣量改為10 μL，則峰型正常。如果減少進(jìn)樣量仍不能解決，再考慮更換其他品牌的色譜柱，如果沒有多余色譜柱，則可試做其他品種，觀察其他對照品是否出現(xiàn)類似情況。筆者多年的實踐發(fā)現(xiàn)，色譜柱使用多年后或損壞時，會將對照品峰分成2個，小峰多在右側(cè)。這時可以采取有把握的反沖色譜柱或不同極性有機(jī)溶劑長時緩沖色譜柱，盡可能使色譜柱再生。

2 理論板數(shù)不能滿足要求

在《中國藥典》2010年版一部中，理論板數(shù)是色譜系統(tǒng)適應(yīng)性的重要指標(biāo)，明確規(guī)定了其下限。檢驗時有時候會出現(xiàn)理論板數(shù)低于下限值。這時先觀察理論板數(shù)的實際值與規(guī)定最小值相差多少，如果不是太大，可通過減少進(jìn)樣量來有效提高理論板數(shù)，減少進(jìn)樣量也就減小了半峰寬，根據(jù)理論板數(shù)的計算公式知當(dāng)保留時間不變的情況下，半峰寬減小，理論板數(shù)增大。如果相差較大，減少進(jìn)樣量也不能滿足要求，再考慮更換色譜柱、調(diào)整流動相、柱溫。

3 分離度不能滿足要求

在《中國藥典》2010年版一部中，分離度也是色譜系統(tǒng)適應(yīng)性的一個指標(biāo)，檢驗時有時會出現(xiàn)兩個物質(zhì)不能有效分離，如果遇這種情況，筆者認(rèn)為可以考慮更換色譜柱，這樣既簡捷也比較有效。不同品牌、規(guī)格的色譜柱有各自的特點，對同一物質(zhì)的洗脫分離能力各不相同。比如筆者在做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司，批號：10082011）的含量測定時，設(shè)定的檢驗條件：菲羅門Luna柱，柱溫35℃，流動相各組分比例與標(biāo)準(zhǔn)相同，流速1.60 mL/min，進(jìn)樣20 μL；人參皂苷Rg1與人參皂苷Re不能有效分離。將檢驗條件改為菲羅門Gemini柱，柱溫40℃，其他條件不變，則分離度達(dá)到要求。或者將檢驗條件改為Kromasil 100-5 C18柱，其他條件不變，則分離度也能達(dá)到要求。如果沒有多余的色譜柱，可以多次調(diào)整流動相的比例，通過改變流動相的極性，使被測物質(zhì)峰的分離度達(dá)到要求。

通常情況下，進(jìn)針都是先進(jìn)對照品再進(jìn)供試品，但由于有時會出現(xiàn)供試品中被測物質(zhì)峰與雜質(zhì)峰分離度不能滿足要求，而使前面對照品進(jìn)針不能使用的情況，所以對于第一次做的品種，檢驗開始最好先進(jìn)一針對照品再進(jìn)一針供試品，以確定檢驗條件二者都能滿足后，再按常規(guī)完成進(jìn)針。

4 供試品中被測物質(zhì)峰面積突然增大或峰型異常

在檢驗過程，有時供試品中被測物質(zhì)峰會突然出現(xiàn)峰面積增大，或峰型異常。比如筆者在做通竅鼻炎片[4]1057-1058（中山市中智制藥有限公司，批號：20091236）、羚羊感冒片[3]608（黑龍江天宏藥業(yè)有限公司，批號：20080201）、抗感顆粒[3]471（四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：080807）的含量測定時，就出現(xiàn)過這種情況。筆者多次實驗后發(fā)現(xiàn)，這種情況主要是由于供試品中雜質(zhì)峰干擾導(dǎo)致，供試品的前幾針多不會出現(xiàn)這種情況，一般在第5、6針時開始出現(xiàn)，是由于前面供試品中一些在該波長下有吸收的雜質(zhì)一針一針的逐漸從色譜柱中洗脫下來，碰巧出現(xiàn)在被測物質(zhì)出峰的時間段內(nèi)，與被測物質(zhì)峰完全重疊，則峰面積增大，不完全重疊則影響被測物質(zhì)峰型而出現(xiàn)峰型異常。遇到這種情況，筆者認(rèn)為要認(rèn)真分析前面的色譜圖，找出雜質(zhì)峰出峰的規(guī)律，找到合適的時間進(jìn)針，避開雜質(zhì)峰就可以了。當(dāng)然也可以等待，不再進(jìn)針，讓干擾雜質(zhì)全部流出后再進(jìn)針。比如筆者在做復(fù)方黃連素片[4]923（成都森科制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51021798）中芍藥苷的含量測定時，按常規(guī)操作供試品通常在進(jìn)第5或6針時，出現(xiàn)強(qiáng)吸收且亂的雜質(zhì)峰（多個廠家生產(chǎn)的該品種都出現(xiàn)類似的情況）。由于雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重，很難有效避開雜質(zhì)峰，多進(jìn)一針很可能會增加更多等待時間。其次想讓雜質(zhì)峰出的更快些，如果用甲醇、乙腈沖柱，一定要用5%～10%甲醇過渡，因為流動相中含磷酸二氫鉀，防止鹽析出而導(dǎo)致儀器故障，當(dāng)然來回平衡流動相也很費(fèi)時間。

5 其他問題

檢驗中，有時會出現(xiàn)被測物質(zhì)的保留時間較長。這時，筆者認(rèn)為可以考慮在滿足被測物質(zhì)分離度的條件下縮短被測物質(zhì)的保留時間，加快檢驗的完成，節(jié)約時間，減少人力、物力的消耗?？s短被測物質(zhì)的保留時間最常見的方法就是調(diào)整流動相各組分比例、升高柱溫、增加流速，其中以調(diào)整流動相組分比例的效果最為顯著。由于藥典中使用的色譜柱多要求為以O(shè)DS為填充劑，屬于反相色譜柱，所以合理增加流動相中甲醇或乙腈的比例，一般都能縮短被測物質(zhì)的保留時間。比如筆者在做復(fù)方丹參片[3]527（深圳同安藥業(yè)有限公司，批號：080702）中丹參酮ⅡA的含量測定時，用菲羅門Luna柱，流動相組分比例由標(biāo)準(zhǔn)中的比例調(diào)整為甲醇-水（75∶25）；做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司，批號：10082023）含量測定時，用菲羅門 Gemini柱，流動相各組分比例由標(biāo)準(zhǔn)中的比例調(diào)整為乙腈-0.05%磷酸溶液（21∶81）；通過調(diào)整，它們都能縮短被測物質(zhì)的保留時間，且滿足藥典要求。

有時還會遇到被測物質(zhì)出峰時基線較高，色譜圖質(zhì)量不佳的情況，這時，筆者認(rèn)為可以考慮減小進(jìn)樣量來優(yōu)化檢驗工作。比如筆者在做生脈注射液[5]（四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司，批號：10082011）含量測定時，設(shè)定檢驗條件：Kromasil 100-5 C18柱，柱溫30℃，流動相各組分比例與標(biāo)準(zhǔn)同。按標(biāo)準(zhǔn)操作供試品濃縮5倍，進(jìn)樣20 μL，濃縮后的供試品顏色深，這時色譜圖上顯示人參皂苷Rg1、人參皂苷Re出峰時，峰起點被抬至23 mV左右。如果將進(jìn)樣量調(diào)整為5 μL，則出峰時基線略抬高，峰面積波動更小，色譜圖質(zhì)量提高了，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也更容易滿足要求。

6 小結(jié)

《中國藥典》2010年版規(guī)定：各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變[4]附錄36。合理調(diào)整這些可變的檢驗條件是解決問題的重要途徑。如何準(zhǔn)確設(shè)定檢驗條件，除了在檢驗工作中不斷積累經(jīng)驗外，查閱藥典、期刊雜志、專業(yè)書籍也非常重要，這樣不但可以了解同一被測物質(zhì)還有那些不同檢測條件，豐富檢驗知識，更為檢驗條件設(shè)定提供參考和借鑒。

[1]凌志甫，陳博，龐裕玉，等.高效液相色譜法在藥品“打假”中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6（7）：131-132.

[2]劉月娥，黃安軍.基層實驗室高效液相色譜儀的常見問題與對策[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（4）：310-312.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[5]國家藥典委員會.中國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-2865-98）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：51.

Discussion on common problems in traditional Chinese medicine inspection with conventional HPLC method

LI Jinping
Institute for Food and Drug Control in Panzhihua City,Sichuan Province,Panzhihua 617000,China

ObjectiveTo discusse the common problems encountered during traditional Chinese medicine inspection with conventional High Performance Liquid Chromatography method(ODS column,ultraviolet detector).MethodsThese problems were analyzed with years of practices and experiences of the author in drug inspection.ResultsMethods and countermeasures were put forward to dissolve these common problems.ConclusionWith the problems tackled case-by-case,reasonable adjustment of variable inspection conditions is an important way for problem solving.

Traditional Chinese medicine;HPLC;Drug inspection

R927.2

C

1673-7210（2012）08（c）-0152-02

2012-03-31 本文編輯：衛(wèi) 軻）