常 江，孫忠人

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

針刺預(yù)處理對(duì)缺血再灌注高脂血大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及血清SOD、MDA含量的影響

常 江，孫忠人△

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

目的:探討針刺預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及血清SOD、MDA水平的影響。方法:高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，用“推管法”制作心肌缺血再灌注大鼠動(dòng)物模型，采用HE染色技術(shù)檢測(cè)心肌組織結(jié)構(gòu)，檢測(cè)大鼠血清中SOD活性、MDA含量變化。結(jié)果:針刺預(yù)處理組大鼠較缺血再灌注組心臟組織病理改變明顯減輕，SOD活性明顯增加、MDA含量明顯減低(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:針刺預(yù)處理能有效的抑制缺血再灌注高脂血癥大鼠心臟組織的病理改變、清除氧自由基，是減輕缺血再灌注對(duì)心肌損傷的可能機(jī)制。

針刺預(yù)處理;高脂血癥;心肌缺血再灌注

心臟的缺血性改變已成為世界范圍內(nèi)致病致死的主要原因之一，高脂血癥是其發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。缺血預(yù)處理方法的提出使此類(lèi)疾病的治療方法進(jìn)行了優(yōu)化，為缺血再灌注損傷的防治提供了新思想。針刺預(yù)處理，是中醫(yī)的“治未病”理論和缺血預(yù)處理的中西醫(yī)結(jié)合，實(shí)驗(yàn)研究［1］也證實(shí)針刺預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注治療作用明顯。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)針刺預(yù)處理對(duì)高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注血清SOD活性、MDA含量的影響，深入研究并探討針刺預(yù)處理對(duì)高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注心臟結(jié)構(gòu)損傷可塑性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇2月齡健康SD雄性大鼠，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。正常飼養(yǎng)1周，后給予大鼠高脂飲食，共飼養(yǎng)28天，入選標(biāo)準(zhǔn):血脂檢測(cè)(TC、TG、HDL、LDL)，以結(jié)果高出普食組健康雄性SD大鼠3倍為指標(biāo)入選。選取合格大鼠24只。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將高脂血癥大鼠24只，隨機(jī)分為4組，每組6只。分組處理如下:假手術(shù)組:僅暴露其心臟，不作處理;缺血再灌注組(IR組):大鼠開(kāi)胸后結(jié)扎缺血20 min，然后灌注40 min;缺血預(yù)處理組(IP組):大鼠開(kāi)胸后結(jié)扎缺血5 min，然后灌注5 min，重復(fù)此操作2次用時(shí)20 min，再結(jié)扎缺血20 min，然后灌注40 min;針刺預(yù)處理組(針刺組):針刺大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)、膻中穴共7天，每天1次，每次20 min。除針刺預(yù)處理組外其他3組，每天捆綁1次，共7天，每次20 min。

1.3 試劑與儀器

SOD、MDA試劑盒(南京建成生物)，LEICARM2145型石蠟切片機(jī)，BH2型OLYMPUS顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 在體心肌缺血再灌注損傷模型:腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，捆綁動(dòng)物，手術(shù)臺(tái)上仰臥、固定，將電極接于四肢，記錄動(dòng)物心電圖。在頸部除毛后剪長(zhǎng)約2.5 cm的小口暴露氣管，氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，呼氣、吸氣之比為2∶1，頻率為70～80次/min，潮氣量為1～1.5 ml/ 100 g。沿胸骨左緣約0.5 cm處剪斷第3、4肋骨，以胸骨左緣第3、4肋為處理點(diǎn)，剪斷肋骨以暴露胸腔。左冠狀動(dòng)脈下用無(wú)損傷縫合針縫針，穿入膠管使用推管法造成缺血再灌注處理。觀察左室前壁發(fā)紺，向外膨脹同時(shí)發(fā)生心電圖S－T段改變?yōu)槿毖臉?biāo)志。假手術(shù)模型:方法同上，開(kāi)胸后不進(jìn)行結(jié)扎處理，關(guān)胸。其余組按以上方法進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.4.2 取材及標(biāo)本制備 各組動(dòng)物模型成功建立后，將動(dòng)物麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)胸壁暴露心臟，立即作左心室插管，取血測(cè)定血清SOD、MDA含量。然后用生理鹽水灌注，剪開(kāi)右心房，同時(shí)打開(kāi)腹腔暴露肝臟，至肝臟變白，約灌注20 min，再用4%多聚甲醛/0.1%DEPC灌流固定約40 min，取心臟組織浸入固定液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm片厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè) 心肌病理組織變化:HE染色后光鏡觀察組織病理學(xué)變化。血清SOD、MDA含量的檢測(cè):SOD活力和MDA含量參照試劑盒說(shuō)明的方法進(jìn)行操作。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用單因素方差分析(one－way ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌HE染色結(jié)果

HE見(jiàn)假手術(shù)組:心肌纖維排列整齊，形態(tài)完整，胞漿豐富，胞核飽滿，核仁及細(xì)胞邊界清晰、染色均勻，細(xì)胞核位于肌纖維中央，心肌間質(zhì)和心肌未見(jiàn)異常，見(jiàn)封三彩圖1。缺血再灌注組:有明顯的組織損傷，可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，纖維腫脹，胞核濃縮，核仁不清，少數(shù)的心肌纖維出現(xiàn)斷裂、破壞，局部出現(xiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)封三彩圖2。缺血預(yù)處理組:見(jiàn)內(nèi)層心肌片狀纖維嗜伊紅染濃染及毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，病態(tài)較缺血再灌注組減輕，見(jiàn)封三彩圖3。針刺預(yù)處理組:可見(jiàn)毛細(xì)血管充血，纖維腫脹，但其范圍較缺血再灌注組明顯縮小，少數(shù)心肌纖維胞漿嗜伊紅濃染，胞核濃縮，心肌纖維排列較整齊，未見(jiàn)明顯肌纖維斷裂，見(jiàn)封三彩圖4。

2.2 大鼠血清SOD、MDA含量的變化

SOD活性值和MDA含量值缺血再灌注組(IR組)與假手術(shù)組比較差異有非常顯著意義(P＜0.01)，針刺預(yù)處理組(針刺組)與缺血再灌注組(IR組)比較差異有非常顯著意義(P＜0.01)，缺血預(yù)處理組(IR組)與缺血再灌注組(IR組)比較有非常顯著意義(P＜0.01)，針刺預(yù)處理組與缺血預(yù)處理組(IR組)比較有顯著差異。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清SOD活性、MDA含量值(±s)

表1 大鼠血清SOD活性、MDA含量值(±s)

注:與假手術(shù)組同時(shí)相點(diǎn)比較，①P＜0.01;與IR組同時(shí)相點(diǎn)比較，②P＜0.01;與IP組同時(shí)相點(diǎn)比較，④P＜0.01，⑤P＜0.05。

組別 例數(shù) SOD活力(U/mgprot) MDA含量(nmol/mgprot)假手術(shù)組6 80.69±2.49 11.78±0.76 IR組 6 71.50±1.33① 22.99±2.46①I(mǎi)P組 6 77.18±2.27② 15.13±1.52②針刺組 6 79.49±1.66④② 13.93±1.35⑤②

3 討論

研究表明［2］高脂血癥是心血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血的發(fā)生。其相關(guān)機(jī)制與增加血液粘稠度使局部凝血機(jī)制亢進(jìn)有關(guān)，在損傷血管機(jī)構(gòu)的基礎(chǔ)上使相應(yīng)血管供應(yīng)區(qū)組織缺血，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)損傷。本實(shí)驗(yàn)研究表明高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注后組織病理變化顯著，出現(xiàn)了明顯的組織損傷及炎性反應(yīng)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為［3～6］，氧自由基的產(chǎn)生是引起心肌缺血再灌注損傷的主要因素，在心臟缺血時(shí)能量代謝障礙，細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)受損，與氧反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基，又因缺血心肌清除自由基的酶類(lèi)的能力及含量均降低，使其大量堆積，而損傷細(xì)胞，使膠質(zhì)和透明質(zhì)酸崩潰，使膜磷質(zhì)結(jié)構(gòu)的多價(jià)不飽和脂肪酸過(guò)氧化而使細(xì)胞受損。因此抑制氧自由基的產(chǎn)生可預(yù)防和減輕此類(lèi)反應(yīng)。SOD是心肌內(nèi)重要的抗氧化酶，作用是清除氧自由基，MDA是氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，反應(yīng)了心肌損傷的程度［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過(guò)針刺預(yù)處理能有效地改善高脂血癥大鼠缺血再灌注引起的心肌組織的損傷程度，并且能夠明顯的降低MDA的含量，增加SOD的活性，減輕了氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用。為臨床治療心臟缺血性疾病提供了新的理論依據(jù)，有利于優(yōu)化臨床治療方案。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)將心肌缺血性損傷的臨床表現(xiàn)歸屬于“胸痹”、“厥心痛”、“真心痛”等范疇。對(duì)于其治療方法，《靈樞·脈經(jīng)》篇云:“手心主之別，名曰內(nèi)關(guān)。去腕二寸，出于兩筋之間，別走少陽(yáng)，循經(jīng)上系心包，絡(luò)心系。心系實(shí)則痛，虛則為煩心，取之兩筋間也”，說(shuō)明了內(nèi)關(guān)穴對(duì)心臟疾病的治療作用?，F(xiàn)代研究［8］也證明針刺內(nèi)關(guān)穴能有效的改善冠心病患者心功能，減少氧自由基的生成，對(duì)心肌能量代謝障礙有改善作用。膻中屬任脈，為氣會(huì)。《醫(yī)貫》云:“心之下有心包絡(luò)，即膻中也，象如仰盂，心即居其中”，膻中為心主之宮城。針刺膻中穴使氣行則血行，改善因血瘀而引起的高脂血癥致心肌缺血性改變。

綜上所述，心肌缺血再灌注后對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而使其功能產(chǎn)生障礙。高脂血癥是產(chǎn)生此類(lèi)損傷的危險(xiǎn)因素，由此而產(chǎn)生的一系列相關(guān)的改變，如血液粘稠度增加、血管壁結(jié)構(gòu)的改變等，使它成為了致病的敏感因素。SOD活性和MDA含量的改變也間接的證明氧自由基的產(chǎn)生與消除是導(dǎo)致心臟缺血性改變的可能誘發(fā)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)證明，針刺內(nèi)關(guān)穴、膻中穴進(jìn)行預(yù)處理能有效的使高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注后SOD活性增加，MDA含量減少，對(duì)心肌因缺血使結(jié)構(gòu)損傷具有明顯的預(yù)防及可塑作用，是中醫(yī)“治未病”思想的體現(xiàn)。

［1］李春磊，孫忠人，宋春燕，等.針刺預(yù)處對(duì)心肌缺血大鼠血清SOD、MDA水平的影響［J］.針灸臨床雜志，2006，22(6):46－47

［2］陳偉平，毛童俊，樊林，等.紫心甘薯對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激的影響［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，20(4):32－35

［3］李應(yīng)東，趙信科，劉凱.當(dāng)歸紅芪超濾物對(duì)急性心肌梗死大鼠SOD、MDA、LDH1及HSP70的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(10):2430－2433

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［6］艾偉，孔維佳.氧自由基對(duì)豚鼠耳蝸微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，38(3):359－363

［7］張紅星，周利，黃國(guó)付，等.電針刺激內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷家兔心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的影響［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2007，29(1):13－16

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Changes of Organizational Structure of Myocardium and SOD，MDA content in Model Rats with Ischemic Reperfusion Injury and Hyperlipemia by Acupuncture Preconditioning

CHANG Jiang，SUN Zhong－ren△
(Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin150040，China)

Objective:To explore the changes of organization structure of cardiac muscle and SOD，MDA content in model rats with ischemic reperfusion injury hyperlipemia by acupuncture preconditioning.Methods:Establish ischemia reperfusion injury model rats by pushing tube.HE staining technique was used to examine the change of organization structure of myocadium.The SOD，MDA content was determined.Results:In comparison with IR group，the pathologic changes of organization structure of myocardium in Acupuncture Preconditioning group decreased more significantly，the SOD content increased more markedly，the MDA content decreased more markedly(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion:Acupuncture preconditioning can effectively cause the inhibition of the pathologic changes of organization structure of myocardium and clean out oxyradical，which may be the mechanism that acupuncture preconditioning reduces the injury of ischemic reperfusion.

Acupuncture preconditioning;Hyperlipemia;Myocardial ischemia reperfusion

R246.1

A

1005－0779(2012)006－0056－03

常江(1984－)，男，2009級(jí)針灸推拿專(zhuān)業(yè)碩士研究生。

△通訊作者:孫忠人(1960－)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:針刺治療心腦血管疾病。

2011－11－04