孫遠(yuǎn)征，徐 軍，王春霞，許 娜，王雅青

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

頭穴叢刺對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙及VEGF蛋白表達(dá)的影響

孫遠(yuǎn)征1，徐 軍2，王春霞1，許 娜2，王雅青2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

目的:觀察頭穴叢刺對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙及VEGF表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法:采取國內(nèi)改進(jìn)的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制備慢性腦缺血大鼠模型，制備成功的大鼠隨機(jī)分為3組:缺血組、頭穴叢刺組、尼莫地平組。Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察大鼠額葉皮層和海馬區(qū)的細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組化檢查VEGF蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果:與假手術(shù)組相比，缺血組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05);與缺血組大鼠比較，頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠額葉皮層和海馬區(qū)VEGF蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.05)。結(jié)論:頭穴叢刺法能上調(diào)VEGF在慢性腦缺血大鼠中的表達(dá)，減輕大鼠的缺血缺氧情況，改善慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙的狀況。

慢性腦缺血;認(rèn)知功能;頭穴叢刺;VEGF

慢性腦缺血作為一種常見的病理狀態(tài)，是指各種原因引起的長期的腦血流灌注不足的狀態(tài)。目前研究表明，長期的慢性腦缺血是形成血管性癡呆(VD)的重要因素之一。其發(fā)病早期的主要表現(xiàn)是認(rèn)知功能的損害［1］，最終可能演變?yōu)槌志没蜻M(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙。雖然目前針對改善癡呆所致的認(rèn)知功能的方法有很多，諸如使用腦保護(hù)劑，國際上多個循證醫(yī)學(xué)指南推薦使用的尼莫地平來防治癡呆。但藥物的長期使用對身體造成了一定的負(fù)面影響。于致順教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，采用頭穴叢刺治療腦缺血取得良好效果，但目前為止，利用頭穴叢刺治療慢性腦缺血的研究還較少，本實(shí)驗(yàn)本著簡便、環(huán)保、長期施治的原則，采用頭穴叢刺的方法，通過研究VEGF在腦組織中的表達(dá)，來探討頭穴叢刺對慢性腦缺血大鼠致認(rèn)知功能障礙的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選用Wistar大鼠60只，體重200～250 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。經(jīng)過Morris水迷宮篩選后，隨機(jī)分5籠飼養(yǎng)，選擇其中1籠作為假手術(shù)組(A組)，其他4籠鼠均進(jìn)行建模手術(shù)。將手術(shù)幸存的大鼠進(jìn)行水迷宮篩選后，隨機(jī)分成3組:缺血組(B組)、頭穴叢刺組(C組)、尼莫地平組(D組)。

1.2 主要試劑和材料

兔抗大鼠HIF－1a抗體、兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑(均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，Olympus照相顯微鏡(日本olympus公司)。

1.3 模型建立和標(biāo)本采集

慢性腦缺血模型制備參照Liu HN［2］改進(jìn)的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法進(jìn)行。頭穴叢刺組(C組)參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠的穴位定位方法取穴［3～5］，選取“百會”及百會左右旁開1 mm共3個點(diǎn)，以30號0.5寸毫針平行向額葉透刺，每天2次，每次同一時段針刺留針30 min，間隔10 min進(jìn)行捻轉(zhuǎn)行針，200轉(zhuǎn)/ min，每次5 min。尼莫地平組(D組)用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解尼莫地平(每20 mg尼莫地平溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100 ml配成0.02%懸浮液)后，按1 mg/kg給予大鼠灌胃處理，每天2次，每次同一時段進(jìn)行。假手術(shù)組(A組)不做任何處理，4周后各組大鼠進(jìn)行斷頭處理。

1.4 行為學(xué)檢測方法

采用Morris水迷宮分別于手術(shù)前、手術(shù)后4周、及治療4周后3個時間點(diǎn)對大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的測試，包括定向航行和空間探索兩部分，重點(diǎn)記錄大鼠的逃避潛伏期和撤去平臺后大鼠在原象限平臺停留的時間。每次持續(xù)5天，前4天進(jìn)行定向航行，第5天進(jìn)行空間探索。每次每天在同一時間段進(jìn)行。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

1.5 病理組織學(xué)檢查

治療結(jié)束后以10%水合氯醛麻醉，固定在實(shí)驗(yàn)臺上，打開胸腔，先用生理鹽水約200～300 ml灌洗，再用4%的多聚甲醛固定，直至動物頭部及頸部呈僵硬狀態(tài)，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛中固定4～6 h，石蠟包埋，作4～6 mm厚度切片。行常規(guī)HE染色，用光鏡觀察各組大鼠額葉皮層及海馬的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;用免疫組化法檢測各組大鼠額葉皮層及海馬區(qū)的VEGF蛋白的表達(dá)情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)都取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，用方差齊性分析，組間用LSD檢驗(yàn)，取P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化

與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化明顯(P＜0.05)，說明造模成功;治療后，頭穴叢刺組、尼莫地平組相對于缺血組學(xué)習(xí)記憶能力有了進(jìn)一步的提高(P＜0.05)，說明介入治療在一定程度上改善了慢性腦缺血大鼠致認(rèn)知功能障礙;頭穴叢刺組和尼莫地平組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明頭穴叢刺法在改善慢性腦缺血大鼠致認(rèn)知功能障礙方面的效果和尼莫地平組一樣。見表1、2。

表1 各組大鼠于同一時間段比較逃避潛伏期(±s，單位:s)

表1 各組大鼠于同一時間段比較逃避潛伏期(±s，單位:s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與缺血組比較，ΔP＜0.05;與尼莫地平組比較，#P＞0.05。

組別 手術(shù)前 手術(shù)后4周 治療4周后假手術(shù)組35.65±4.09 31.64±3.76 22.62±1.40缺血組 35.02±2.58 45.96±1.94* 40.58±1.52*頭穴叢刺組 33.56±3.94 46.59±2.11*Δ# 29.62±2.05*Δ#尼莫地平組 34.30±3.24 46.07±1.78*Δ 30.98±2.17*Δ

表2 各組大鼠于同一時間段比較撤去平臺后停留在原平臺象限的時間(±s，單位:s)

表2 各組大鼠于同一時間段比較撤去平臺后停留在原平臺象限的時間(±s，單位:s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與缺血組比較，ΔP＜0.05;與尼莫地平組比較，#P＞0.05。

組別 手術(shù)前 手術(shù)后4周 治療4周后假手術(shù)組35.26±3.12 40.25±1.47 49.34±2.32缺血組 35.13±2.38 26.24±1.13* 29.93±1.36*頭穴叢刺組 34.78±1.85 25.99±1.31*Δ# 40.67±2.19*Δ#尼莫地平組 33.59±2.19 27.08±1.14*Δ 40.01±1.54*Δ

2.2 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠額葉皮層見椎體細(xì)胞數(shù)目多，排列緊湊，染色淺;海馬區(qū)4至多層細(xì)胞染色淺，排列緊密，偶見固縮細(xì)胞或基本正常，見封三彩圖1。缺血組大鼠額葉皮層椎體細(xì)胞數(shù)目明顯減少，排列疏松，細(xì)胞周圍間隙明顯，形態(tài)不規(guī)則，呈三角形，胞質(zhì)染色不均但著色深，有空泡形成;海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且層次不清，形態(tài)不規(guī)則，少量細(xì)胞脫落、排列松散，可見大量固縮細(xì)胞，胞質(zhì)染色不均，有空泡形成，核仁顯示不清，見封三彩圖2。頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠額葉皮層椎體細(xì)胞數(shù)目較多，排列緊湊，形態(tài)大體規(guī)則，可見少量固縮細(xì)胞;海馬區(qū)細(xì)胞輕度減少，細(xì)胞排列層次及形態(tài)清晰，胞質(zhì)染色均勻而色淺，可見少量固縮細(xì)胞，見封三彩圖3、4。

2.3 VEGF蛋白的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠額葉皮層和海馬區(qū)的VEGF表達(dá)有了明顯的提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明造模成功;尼莫地平組和頭穴叢刺組與缺血組比較，VEGF表達(dá)有了更進(jìn)一步的提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明介入治療后一定程度上上調(diào)了VEGF的表達(dá);尼莫地平組和頭穴叢刺組相比較，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩種方法上調(diào)VEGF表達(dá)的程度無大的差別。見表3。

表3 不同腦組織VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s)

表3 不同腦組織VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與缺血組比較，ΔP＜0.05;與尼莫地平組比較，#P＞0.05。

組別 皮層 海馬區(qū)假手術(shù)組0.095±0.012 0.032±0.001缺血組 0.476±0.035* 0.483±0.026*尼莫地平組 0.694±0.028Δ 0.748±0.031Δ頭穴叢刺組 0.682±0.031Δ# 0.751±0.021Δ#

3 討論

長期的慢性腦供血不足產(chǎn)生的慢性腦缺血是一種病理狀態(tài)，他常伴發(fā)于腦動脈硬化、血管性癡呆(VD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、賓斯旺格(Binswanger disease，BD)和動靜脈畸形等多種疾病的病理過程中。近年來對于慢性腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究也逐漸受到關(guān)注，相關(guān)文獻(xiàn)報道層出不窮。研究表明，低灌注及低代謝狀態(tài)下，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退［6］。孫強(qiáng)［7］研究慢性腦供血不足的基礎(chǔ)及臨床研究也指出慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重者可導(dǎo)致癡呆。本實(shí)驗(yàn)采用國內(nèi)改進(jìn)的雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備慢性腦缺血大鼠模型，Morris水迷宮證實(shí)術(shù)后4周大鼠相比術(shù)前學(xué)習(xí)記憶能力有所減退(P＜0.05)。

慢性腦缺血早期最具特征性臨床表現(xiàn)為近記憶力的減退，類似于中醫(yī)的“癡證”、“呆病”的早期階段。針對癡證或呆病，傳統(tǒng)取穴是依據(jù)局部取穴的原理選取百會、四神聰作為主穴，再辨證分型選取配穴。于致順教授經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐研究，提出于氏叢刺法的觀點(diǎn)來治療腦血管疾病。于氏將頭部劃分為7個區(qū)域，頂區(qū)、頂前區(qū)、額區(qū)、枕區(qū)、枕下區(qū)、顳區(qū)、項(xiàng)區(qū)。其中有關(guān)學(xué)習(xí)記憶能力的部分主要分布在額區(qū)和顳區(qū)。根據(jù)以上情況及實(shí)驗(yàn)本身的局限，本實(shí)驗(yàn)采用百會穴及旁開1 mm的兩個點(diǎn)向額區(qū)透刺，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明頭穴叢刺能改善慢性腦缺血大鼠致認(rèn)知功能障礙的情況。曹華［8］研究頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練干預(yù)輕度認(rèn)知功能障礙也取得了較好的療效。由此推測，頭穴叢刺可能誘導(dǎo)了大鼠額區(qū)及顳區(qū)的腦血流量和血流容積的增加。促進(jìn)了毛細(xì)血管、膠質(zhì)細(xì)胞纖維的增生，抑制了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡壞死。

近年來相關(guān)研究表明，VEGF作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，在胚胎的發(fā)育、傷口的愈合、炎癥、腫瘤、缺血、缺氧等病理過程中發(fā)揮著重要的作用。不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)微血管形成，還能直接作用于多種類型的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮著神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用，可增強(qiáng)細(xì)胞活性和存活能力，并能促進(jìn)軸突再生［9～10］。LI Bao－dong［11］研究頭穴叢刺對大鼠缺血腦組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響結(jié)果表明頭穴叢刺法能上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)微血管的新生。

本實(shí)驗(yàn)中，缺血組大鼠額葉皮層及海馬區(qū)的VEGF表達(dá)較對照組明顯升高(P＜0.05);相比于缺血組，頭穴叢刺組和尼莫地平組的VEGF表達(dá)又進(jìn)一步提高(P＜0.05)。同時，HE染色顯示頭穴叢刺組和尼莫地平組的細(xì)胞缺血損傷較缺血組輕。由此可見，VEGF做為一種保護(hù)性因子，對慢性腦缺血大鼠有腦保護(hù)作用。研究表明慢性腦缺血可持續(xù)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，說明其在慢性腦缺血的代償修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。而頭穴叢刺和尼莫地平都能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來達(dá)到腦保護(hù)的作用。

綜上所述，頭穴叢刺法能上調(diào)慢性腦缺血大鼠腦額葉皮層和海馬區(qū)的VEGF的表達(dá)，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)微血管的形成、側(cè)枝循環(huán)的建立，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡來改善額葉及海馬區(qū)的血液供應(yīng)，保護(hù)腦組織，改善因缺血缺氧造成的認(rèn)知功能障礙。因此在針對慢性腦缺血的內(nèi)科治療上，尋找到了一條新的出路，避免了長期服用藥物所帶來的對人體的負(fù)面影響。當(dāng)然，由于實(shí)驗(yàn)大鼠的特殊生理構(gòu)造，在頭穴叢刺取穴方面存在一定的局限性，但在臨床上可以大膽的取額區(qū)及顳區(qū)進(jìn)行頭穴叢刺觀察療效。同時，今后的研究方向也可以向針?biāo)幗Y(jié)合發(fā)展，爭取做到短期內(nèi)取得最大療效。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Point on Cognitive Function and Expression of VEGF in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

SUN Yuan－zheng1，XU Jun2，WANG Chun－xia1，XU Na2，WANG Ya－qing2
(1.The Second Affiliated Hosptial of Heilongjiang Univversity of Chinese Medicine，Harbin150001，China; 2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin150040，China)

Objective:To observe the effect of cluster needling of scalp point on cognitive function and expression of VEGF in rats with chronic cerebral ischemia，and to explore the mechanism.Methods:To make the chronic ischemia model through improved permanent bilateral carotid arteries occlusion.The surviving rats were randomly divided into three groups:the group of ischemia，the group of cluster needling，the group of Nimodipine.To check the ability of leaning and remembering through Morris water labyrinth;to study the morphologic changes with HE staining and the expression of VEGF by immnunohistochemisty method.Results:The escape latency in each trial of the model group were longer than the sham operation(P＜0.05).The expression of VEGF in the cortex of frontal lobe and the hippocampus of rats of the group of cluster Needling and the group of Nimodipine were more than those in the group of ischemia(P＜0.05).Conclusion:The cluster needling of scalp point can reduce the cases of ischemia and anoxia and perfect the state of cognitive impairment through up－regulation the expression of VEGF in rats with chronic cerebral ischemia.

Chronic cerebral ischemia;Cognitive function;Cluster Needling of scalp point;VEGF

R246.6

A

1005－0779(2012)006－0053－04

孫遠(yuǎn)征(1957－)，男，教授，主任醫(yī)師，從事針灸的臨床研究。

2011－11－04