葛平等

[摘要]目的：探討平陽霉素誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中PARP-1、Cyt-C的表達(dá)及可能機制。方法：在體外培養(yǎng)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，設(shè)立兩組：A組為平陽霉素組，其中加入平陽霉素（200μg/ml），誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，B組為空白對照組。對兩組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞通過倒置顯微鏡、電鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化，采用流式細(xì)胞儀檢測平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。利用基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)的基因，從中選定PARP-1及Cyt-C表達(dá)基因，對其進(jìn)行RT-PCR驗證。結(jié)果：平陽霉素（200μg/ml）可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加藥24h后，在倒置顯微鏡和電鏡下觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率可達(dá)13.11%?？瞻讓φ战M血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察無明顯形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率為3.56%。利用基因芯片技術(shù)篩選出兩組差異基因4752個，其中2543個上調(diào)，2209個下調(diào)。應(yīng)用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的蛋白表達(dá)基因：PARP-1、Cyt-C。對其進(jìn)行RT-PCR檢測得到的CT值顯示：平陽霉素藥物組相對于空白組PARP-1及Cyt-C蛋白基因呈高表達(dá)狀態(tài)。結(jié)論：平陽霉素在體外可以通過多種途徑誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中PARP-1及Cyt-C參與了線粒體途徑調(diào)控的凋亡。

[關(guān)鍵詞]血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；平陽霉素；PARP-1；Cyt-C

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

嬰幼兒血管瘤發(fā)病率為1%～2%，尤其發(fā)生于頜面部的約占全身的60%。血管瘤一般出現(xiàn)在出生時或出生后10～14天，大約有40%新生兒在出生時即發(fā)現(xiàn)血管瘤，有兩個生長高峰期，第一個高峰期為4～5月時，此期瘤體迅速增長，另一個生長高峰期為1歲左右，此期血管瘤大小達(dá)到最高峰，1～2歲時開始消退。雖然嬰幼兒血管瘤的生物學(xué)行為是可自行消退的，但血管瘤的消退周期較長（10～12年）、大面積血管瘤消退后會引起局部后遺癥（影響功能和美觀），且特殊部位的血管瘤可能引起嚴(yán)重并發(fā)癥、甚至威脅生命，這些都需要積極干預(yù)治療。

血管瘤的常規(guī)治療方法主要有口服或局部注射糖皮質(zhì)激素、X線放療、放射性同位素注射或貼敷、抗腫瘤藥物局部注射、口服γ-干擾素、激光治療等。目前，臨床上治療血管瘤最廣泛的是局部注射平陽霉素硬化治療。但其誘導(dǎo)凋亡機制仍不明確。

近年來越來越多的實驗研究證明，嬰幼兒血管瘤其消退是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡（apoptosis）所致。多個學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)增生期血管瘤組織中其細(xì)胞凋亡處于較低水平，是消退期細(xì)胞凋亡水平的5倍，并且內(nèi)皮細(xì)胞占這些凋亡細(xì)胞的30%[1]。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑有兩條，第一條是細(xì)胞外途徑（細(xì)胞表面死亡受體通路），另一條是細(xì)胞內(nèi)途徑（線粒體通路）。細(xì)胞外途徑主要涉及Fas/FasL及Caspases，而細(xì)胞內(nèi)途徑主要與Bcl-2、Caspase9、Cyt-C（細(xì)胞色素C，cytochrome C）和Bax等相關(guān)。本研究旨從線粒體途徑闡述平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用機制。通過體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞加入平陽霉素誘導(dǎo)其凋亡，尋找參與線粒體代謝異常及凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)基因，并對尋找出的蛋白表達(dá)基因進(jìn)行驗證。從基因及亞細(xì)胞蛋白組學(xué)層面上對平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機制進(jìn)行深一步研究。為其理論研究提供新的實驗依據(jù)，為血管瘤的臨床治療提供新的思路及方法。

1材料和方法

1.1 材料：體外培養(yǎng)的人增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞由西安交通大學(xué)第二醫(yī)院小兒外科惠贈。傳代培養(yǎng)至第5～6代。主要儀器及試劑：BB16紫外清潔型培養(yǎng)箱（Heraeus美國）、DMLED型倒置顯微鏡（LEICA德國）、流式細(xì)胞儀（FACSCalibur美國）、RPMI-1640培養(yǎng)粉（含L-谷胺酰胺）（GIBCO公司）、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（TMD天津）、氨芐青霉素（美國Sigma公司）、硫酸鏈霉素（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司）、Annexin V-FITC PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：分為未加藥物的空白對照組和加入平陽霉素（200μg/ml）藥物組（平陽霉素為商品化藥物）。將兩組細(xì)胞放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每小時觀察細(xì)胞形態(tài)一次。待藥物作用于細(xì)胞24h后分別收集兩組細(xì)胞。

1.2.2 電鏡觀察藥物作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡：將收集到的兩組細(xì)胞分別制作切片，瑞典LKB-V型超薄切片機進(jìn)行超薄切片50～70nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，日本日立H-600透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率：離心收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌，1000rpm，10min；用250μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并使其濃度為1×106低溫500～1000r/min離心5min棄去染液；加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min； 400目的篩網(wǎng)過濾1次；上流式細(xì)胞儀檢測，并用隨機軟件分析。

1.2.4 基因芯片技術(shù)篩選差異基因：選用基因芯片為Agilent表達(dá)譜芯片（由陜西北美基因有限公司提供），按芯片操作要求檢測。

1.2.5 生物信息學(xué)分析與RT-PCR驗證：應(yīng)用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的蛋白表達(dá)基因：PARP-1、Cyt-C。RT-PCR檢測差異基因。

2結(jié)果

2.1不同時間點藥物作用細(xì)胞反應(yīng)：如圖1所示：（a）2h內(nèi)，細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀排列，細(xì)胞偽足伸展充分，貼壁良好，界線清晰，細(xì)胞核清晰可辯；（b）8h，細(xì)胞間界線開始變得模糊，個別細(xì)胞偽足開始收縮變性，間隙有所增大；（c）24h，大部分細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間間隙明顯增大，細(xì)胞形態(tài)完整，部分細(xì)胞脫壁游離飄浮。

2.2 電鏡觀察結(jié)果：如圖2所示，a空白對照組：正常血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，可見胞漿均一，細(xì)胞表面微絨毛存在，可見相對正常的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，包膜完整。b、c平陽霉素組：腫瘤細(xì)胞電子密度增加，細(xì)胞表面微絨毛樣突起消失，細(xì)胞膜形態(tài)仍然完整，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚形成高密度團(tuán)塊，邊集，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡變化。細(xì)胞內(nèi)可見有凋亡小體形成。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：見圖3。

2.4 基因芯片結(jié)果：利用基因芯片技術(shù)篩選出兩組差異基因4752個，其中2543個上調(diào)，2209個下調(diào)。應(yīng)用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的蛋白表達(dá)基因：PARP-1、Cyt-C。

2.5 RT-PCR驗證結(jié)果：RNA提取過程中可能發(fā)生各種途徑的降解，28S/18S即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)，經(jīng)凝膠電泳鑒定質(zhì)量，圖4示28S/18S為1.8～2.0；表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發(fā)生，證明其完整性。

3討論

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡蛋白酶caspase；另一條是通過線粒體釋放凋亡蛋白酶激活因子來激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡。

3.1 線粒體除了為細(xì)胞提供基本生命活動的能量以外，它還負(fù)責(zé)著感受細(xì)胞內(nèi)外的刺激及氧化壓力（oxidative stress）的大小，它在細(xì)胞內(nèi)作為一個感應(yīng)者（senser）[2-4]，根據(jù)外界刺激壓力的大小來決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。當(dāng)外界微小的刺激或氧化壓力作用于細(xì)胞的時候，線粒體會發(fā)生增生性變化，產(chǎn)生更多的能量（如三磷酸腺苷adenosine triphospate：ATP）來提供給細(xì)胞，以此來應(yīng)對外界刺激及氧化壓力帶來的傷害，從而使細(xì)胞保持其固有生理功能的穩(wěn)定，繼續(xù)存活。當(dāng)氧化壓力及外界刺激超過細(xì)胞內(nèi)線粒體自我修復(fù)所能承受的極限時，線粒體的形態(tài)及結(jié)構(gòu)就會發(fā)生改變，這種改變會使得Cyt-C及AIF（凋亡誘導(dǎo)因子，apoptosis-inducing factor）釋放并進(jìn)入胞漿，這些細(xì)胞因子啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，以此方式清除體內(nèi)那些衰老的、病態(tài)的、不健康的甚至發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞。以下三種機制是線粒體調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑[5-8]，包括：①電子傳遞、氧化磷酸化及ATP產(chǎn)生的破壞；②釋放細(xì)胞色素C來激發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)；③改變細(xì)胞氧化還原位能。當(dāng)外界各種不同的環(huán)境刺激（如紫外線、γ射線、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、生長因子缺失、氧化壓力）作用于細(xì)胞時，過量的活性氧族（reactive oxygen species：ROS）會在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，這些活性氧族可誘導(dǎo)凋亡因子Bcl-2家族蛋白（如Bax和Bak）啟動，并在線粒體外膜上發(fā)生聚合，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而引發(fā)內(nèi)源性途徑使細(xì)胞凋亡[9]。

3.2 平陽霉素（Pingyangmycin，PYM）是一種細(xì)胞毒性糖肽抗腫瘤抗生素。臨床研究證明，平陽霉素是一種療效好、毒性小的抗腫瘤抗生素。20余年來平陽霉素亦用于治療血管瘤，取得良好的效果，已成為血管瘤常規(guī)的治療方法之一[10-13]。平陽霉素治療血管瘤的可能機制有：①使組織纖維化的副作用，研究表明平陽霉素是一種血管形成抑制劑，可通過抑制血管形成而達(dá)到其治療作用；平陽霉素可以引起血管內(nèi)膜管壁結(jié)構(gòu)的病理改變及造成血管內(nèi)皮細(xì)胞變性，促使血栓形成，并使瘤體纖維化，從而抑制血管瘤發(fā)展，使瘤體消退；②平陽霉素直接引起DNA單鏈斷裂，抑制細(xì)胞的代謝，干擾細(xì)胞的分裂增殖[14]；越來越多的研究證明平陽霉素可以有效的誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實驗結(jié)果顯示平陽霉素可以有效的誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在倒置顯微鏡和電鏡下觀察到明顯的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率可達(dá)13.11%。

本實驗利用基因芯片，應(yīng)用DAVID軟件對鑒定出來的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選出與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的蛋白表達(dá)基因：PARP-1[聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，poly（ADP-ribose） polymerase-1]、Cyt-C，并對其進(jìn)行RT-PCR驗證。結(jié)果說明平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與PARP-1、Cyt-C介導(dǎo)的線粒體途徑密切相關(guān)，目前尚無相關(guān)研究報道。

3.3 PARP-1在細(xì)胞凋亡中扮演的角色：PARP-1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中，并在細(xì)胞生命循環(huán)中有重要作用的核因子，該蛋白家族的其它成員包括PARP-2、PARP-3、V-PARP和tankyrases。它的功能是探測DNA損傷，通過特異識別和綁定DNA損傷，使自身激活，對DNA修復(fù)和維持基因的穩(wěn)定性有重要作用。

在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑中， PARP-1被caspase3和caspase7切割為p89和p21兩個片段， 抑制其DNA修復(fù)功能， 使細(xì)胞內(nèi)ATP不至于被PARP-1耗竭， 從而保證凋亡過程中的能量供應(yīng)。然而PARP-1并不僅僅作為死亡底物被動地參與細(xì)胞凋亡，PARP-1過度激活能通過引起線粒體損傷， 誘發(fā)非caspase依賴的細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為除細(xì)胞核外， 還有一部分PARP-1定位于線粒體， 在過度激活時直接引起線粒體損傷和促凋亡蛋白的釋放。另一種可能是， PARP-1 通過其它信號分子引起線粒體功能受損。

本次實驗發(fā)現(xiàn)平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中PARP-1表達(dá)基因呈高表達(dá)。我們推測：平陽霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑可能為：PARP-1可以修復(fù)受損DNA，當(dāng)藥物致DNA大量受損時，PARP-1的過度活化會使細(xì)胞能量儲存耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時，PARP-1低水平的活化也可以使線粒體釋放AIF和Cyt-c，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.4 Cyt C在細(xì)胞凋亡中扮演的角色：Cyt-C由線粒體所釋放，是一種可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子。細(xì)胞色素C是一種水溶性蛋白，由兩種前驅(qū)分子組成，這兩種分子均位于線粒體內(nèi)外膜的間隙內(nèi)，分別是：細(xì)胞核基因所負(fù)責(zé)的前細(xì)胞色素C（procytochrome C）和線粒體內(nèi)合成的亞鐵血紅素（ferrohemoglobin）。亞鐵血紅素基團(tuán)在細(xì)胞呼吸鏈中有重要作用，由于Cyt C具有此基團(tuán)，因此可以在細(xì)胞色素還原酶及細(xì)胞色素氧化酶之間傳遞電子；當(dāng)Cyt C缺乏時，這種電子的傳遞則會受阻，從而導(dǎo)致ATP合成的減少，進(jìn)一步引起線粒體的能量供應(yīng)障礙[15-17]。當(dāng)線粒體外膜通道蛋白發(fā)生改變時，某些特異性凋亡因子則被釋放出來。Cyt C自線粒體釋放至細(xì)胞漿為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，由線粒體釋放Cyt C介導(dǎo)活化Caspase-3引起細(xì)胞凋亡[18]。Cyt C自線粒體釋放至細(xì)胞漿時，在ATP/dATP的協(xié)助下與兩種重要的凋亡因子結(jié)合，分別為：前體凋亡蛋白酶9（procaspase-9）和凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1：Apaf-1）。結(jié)合后的三者形成“Cyt C-Apaf-1-procaspase-9多聚體”，又稱之為凋亡復(fù)合體（apoptosome）。這種凋亡復(fù)合體可以激活并生成caspase9，從而引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，具體表現(xiàn)為caspase9誘導(dǎo)其他的caspase（主要是caspase3、caspase6、caspase7），這些執(zhí)行者caspase引起細(xì)胞皺縮，DNA斷裂并破壞細(xì)胞骨架，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)平陽霉素誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中Cyt C表達(dá)基因呈高表達(dá)。

以上實驗結(jié)果表明，平陽霉素誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑復(fù)雜，涉及多種因素，其中有線粒體凋亡相關(guān)蛋白：PARP-1及Cyt C參與。平陽霉素為治療血管瘤的常用藥物，可以在體外誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，我們在實驗結(jié)果中得到血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中有線粒體途徑參與。我們尚不知是否有其他的凋亡途徑參與到血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。目前這方面的研究也并不完善，對于差異蛋白組中的未知蛋白的作用未能做深入研究，對這些未知蛋白在凋亡過程中發(fā)揮的作用深入研究，有助于我們深刻理解血管瘤的成因及凋亡機制，可能為血管瘤的治療帶來新的思路。

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[收稿日期]2012-08-25 [修回日期]2012-09-16

編輯/張惠娟