袁麗仙，牛艷芬，高麗輝，董馨怡，李 玲，劉 旭

(昆明醫(yī)學(xué)院1.生物醫(yī)學(xué)工程研究中心、2.科研實(shí)驗(yàn)中心，云南昆明 650500)

尿酸(uric acid，UA)是人類嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，任何原因引起UA生成增多和(或)排泄減少均可導(dǎo)致高尿酸血癥。通常高尿酸血癥被認(rèn)為是痛風(fēng)的標(biāo)志，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有5% ～12%的高尿酸血癥患者最終可發(fā)展為痛風(fēng)［1］。近年來隨著我國人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變、肥胖者的增加，痛風(fēng)的發(fā)病率已較15年前增長(zhǎng)了15～30倍，成為我國常見多發(fā)的疾病之一。高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)，最近還發(fā)現(xiàn)它與代謝紊亂綜合征密切相關(guān)，是心血管疾病、高血壓、腎臟疾病等獨(dú)立的危險(xiǎn)因素［2－3］，也已成為嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，聯(lián)合國將其列為21世紀(jì)的20大頑癥之一。

尿酸是由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成的。內(nèi)源性的嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸生成過多，是原發(fā)性高尿酸血癥的重要原因之一。除黃嘌呤氧化酶外，嘌呤代謝過程中還有許多酶的參與，其中嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)也是嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，它催化腺苷、肌苷和鳥苷生成尿酸的前體物質(zhì)腺嘌呤、次黃嘌呤和鳥嘌呤，它的活性異?？蓪?dǎo)致尿酸生成增加，形成高尿酸血癥。

芒果苷(mangiferin，F(xiàn)ig 1)系四羥基吡酮的碳糖苷、屬雙苯吡酮類化合物，存在于多種植物中，資源非常豐富。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)芒果苷的藥理學(xué)活性進(jìn)行了較為廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)芒果苷具有一定的抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤、抗病毒和肝保護(hù)等多種藥理作用［4－8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)芒果苷具有降低尿酸的作用，已獲國家發(fā)明專利，其降尿酸作用與抑制黃嘌呤氧化酶的活性有關(guān)［9］，但對(duì)PNP是否有抑制作用尚未見報(bào)道，因此，本文參照文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)PNP濃度、底物濃度及保持酶穩(wěn)定性的DTT濃度進(jìn)行優(yōu)化，并研究芒果苷及其苷元對(duì)PNP活性的影響。

Fig 1 Chemical structure of mangiferin

1 材料及儀器

1.1主要試劑PNP(批號(hào):57K1480)、鳥苷(批號(hào):106K1848)均為美國Sigma公司產(chǎn)品，PNP蛋白含量57.8%，酶活性31 kU·g－1Pro;二硫蘇糖醇(DTT)為Merck公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2供試藥品芒果苷由昆明醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究中心提供，純度≥95%，芒果苷元由昆明制藥集團(tuán)股份有限公司提供，純度≥98%，臨用前用DMSO配制，終濃度＜1%。

1.3儀器SPECTRA MAX190全波長(zhǎng)紫外－可見光酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品;紫外檢測(cè)板(96孔)為美國Costar公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1體外PNP活性檢測(cè)體系的建立及優(yōu)化參照文獻(xiàn)［10－11］，在96孔紫外檢測(cè)板中加入不同濃度的PNP和 DTT 于 50 mmol·L－1KH2PO4-NaOH(pH 7.5)的緩沖液中，25℃溫育15 min，再加入不同濃度的鳥苷啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)總體積為100 μl。在25℃、波長(zhǎng)258 nm處動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)，確定反應(yīng)的最佳PNP、鳥苷、DTT濃度及反應(yīng)時(shí)間。

2.2芒果苷及苷元對(duì)PNP活性的影響以優(yōu)化后的反應(yīng)體系研究芒果苷和芒果苷元對(duì)PNP活性的影響，即在96孔紫外檢測(cè)板中加入系列濃度的芒果苷(苷元)、250 U·L－1PNP、0.5 mmol·L－1DTT，于25℃預(yù)溫 15 min 后加入鳥苷 400 μmol·L－1啟動(dòng)酶促反應(yīng)，波長(zhǎng)258 nm處動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)15 min，每30 s測(cè)1次，以15 min時(shí)的測(cè)量數(shù)據(jù)按下列公式計(jì)算出酶活性抑制率:酶活性抑制率/%=(酶組OD－樣品組OD)/(酶組OD－空白組OD)×100%。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均用±s表示，采用軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1體外PNP活性檢測(cè)體系的建立及優(yōu)化

3.1.1探索最佳PNP濃度如Fig 2所示，當(dāng)?shù)孜秫B苷濃度為 400 μmol·L－1，PNP 濃度為 125 U·L－1時(shí)，吸光度值(A)減少較緩慢，且變化不大，而酶濃度在250與500 U·L-1時(shí)，吸光度值減少量均較明顯，能較好的反映酶的活力，且兩者的反應(yīng)曲線相似，故本實(shí)驗(yàn)PNP濃度采用250 U·L－1。

3.1.2探索最佳鳥苷濃度由Fig 3可知，隨著鳥苷濃度的增加，底物的消耗量逐漸增多，對(duì)應(yīng)的吸光值變化也逐漸增大，而當(dāng)鳥苷濃度增加至400 μmol·L－1以上時(shí)，其吸光度值變化量減小，由此可見反應(yīng)中的PNP可被濃度為400 μmol·L－1鳥苷完全飽和，在此條件下可完全反映PNP的活力。故本實(shí)驗(yàn)體系中鳥苷濃度采用 400 μmol·L－1。

3.1.3探索最佳DTT濃度隨著DTT濃度的增加，反應(yīng)時(shí)間縮短，反應(yīng)速度加快(見Fig 4)。為便于觀測(cè)反應(yīng)情況，更好地體現(xiàn)PNP的活力，故選用DTT 的濃度為 0.5 mmol·L－1。

Fig 2 Time-course of the PNP activity(n=4)

Fig 3 Effect of guanosine on the time-course of PNP activity(n=4)

Fig 4 Effect of DTT on the time-course of PNP activity(n=4)

3.1.4探索反應(yīng)時(shí)間上述采用的最佳PNP濃度250 U·L－1、最佳鳥嘌呤核苷濃度400 μmol·L－1及最佳DTT濃度所示的吸光度－時(shí)間曲線中可看出，反應(yīng)達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間為7～8 min，考慮到后續(xù)反應(yīng)中受試樣品對(duì)酶的影響，故延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)時(shí)間為15 min。

Fig 5 Time-course of 250 U·L－1PNP(n=4)

3.2芒果苷及苷元對(duì)PNP活性的影響在PNP濃度為 250 U·L－1、底物鳥苷為 400 μmol·L－1、DTT為0.5 mmol·L－1的反應(yīng)條件下，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)15 min，觀察芒果苷及其苷元對(duì)PNP活性的影響。結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，芒果苷及其苷元在濃度高達(dá)100 μmol·L－1時(shí)，對(duì) PNP 的活性沒有明顯抑制作用(Fig 6，7)，反應(yīng)15 min時(shí)的抑制率見Tab 1;溶媒對(duì)照1%DMSO對(duì)PNP活性沒有影響，抑制率為0.18%。

4 討論

PNP參與了嘌呤代謝，是尿酸生成途經(jīng)中的關(guān)鍵酶之一。PNP活性增加，可以促進(jìn)尿酸前體物質(zhì)次黃嘌呤和黃嘌呤的生成增加，最終導(dǎo)致尿酸生成增多，促進(jìn)高尿酸血癥的發(fā)生及痛風(fēng)的形成;PNP的過度抑制則引起體內(nèi)肌苷、鳥苷等的堆積，而高濃度的鳥苷能抑制淋巴細(xì)胞的增殖［12］，因而，維持適當(dāng)?shù)腜NP活性具有重要的意義。

Tab 1 Effects of mangiferin and its aglycone on the activity of purine nucleoside phosphorylase in vitro(±s，n=4)

Tab 1 Effects of mangiferin and its aglycone on the activity of purine nucleoside phosphorylase in vitro(±s，n=4)

Mangiferin Aglycone 1×10－7 Concentration/mol·L －1 Inhibition ratio/%0.74 ±0.21 0.55 ±0.18 1 ×10 －6 0.51 ±0.16 0.98 ±0.33 1 ×10 －5 0.69 ±0.12 0.72 ±0.21 1×10－40.46 ±0.18 0.77 ±0.27

Fig 6 Effect of mangiferin on the time-course of PNP activity(n=4)

Fig 7 Effect of aglycone on the time-course of PNP activity(n=4)

腺苷、肌苷和鳥苷均可作為PNP的底物，目前PNP活性的檢測(cè)方法主要有以鳥苷為底物，在258 nm檢測(cè)底物消耗的紫外檢測(cè)法［10］，以及以肌苷為底物，與黃嘌呤氧化酶聯(lián)合，以尿酸生成量為觀察指標(biāo)的紫外檢測(cè)法［11］，前者較為簡(jiǎn)便，因此，選擇鳥苷作為PNP的底物，采用紫外法測(cè)定PNP的活性。本實(shí)驗(yàn)中PNP為商品化的高純度酶，有較好的活性31 kU·g－1Pro。根據(jù)文獻(xiàn)［10－11］，對(duì)底物、酶、DTT 濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在PNP濃度為250 U·L－1、底物鳥苷為 400 μmol·L－1、DTT 0.5 mmol·L－1的反應(yīng)條件下，PNP表現(xiàn)出較好的活性，有利于酶抑制劑的研究。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)芒果苷灌胃給藥能降低氧嗪酸鉀所致高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，其機(jī)制與抑制黃嘌呤氧化脫氫酶的活性有關(guān)［9］，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究芒果苷及其代謝產(chǎn)物苷元對(duì)嘌呤代謝途徑中的其他關(guān)鍵酶的影響，以明確芒果苷及苷元的降尿酸作用機(jī)制，結(jié)果顯示在本實(shí)驗(yàn)條件下，芒果苷及其苷元在濃度高達(dá)100 μmol·L－1時(shí)，對(duì)PNP的活性沒有抑制作用，提示芒果苷及苷元的降尿酸作用機(jī)制與抑制PNP的活性無關(guān)，可能對(duì)嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化脫氫酶有較高的選擇性。

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