何強強，惠伯棣，宮 平

超臨界CO2密度對全反式番茄紅素吸光系數(shù)的影響

何強強，惠伯棣*，宮 平

(北京聯(lián)合大學應用文理學院， 北京 100191)

目的:通過在超臨界CO2色譜上測定CO2流動相密度與全反式番茄紅素組分峰面積的相關性，推算二氧化碳密度變化對全反式番茄紅素的吸光系數(shù)的影響。方法:超臨界色譜條件:色譜柱:Diamonsil C8(250mm× 4.6mm，5μm)；檢測波長:453nm；壓力變化范圍:11.5～17.5MPa；溫度變化范圍:35～55℃；流速: 2mL/min；進樣量:20μL。結果:全反式番茄紅素組分在超臨界CO2中最大吸收波長處的峰面積是可變的，與CO2密度呈線性正相關。結論:可推斷全反式番茄紅素吸光系數(shù)與超臨界CO2流體密度變化呈正相關。

全反式番茄紅素；超臨界流體色譜；超臨界CO2；密度；吸光系數(shù)

番茄紅素(lycopene)是一種胡蘿卜素(carotene)，系統(tǒng)命名為ψ,ψ-胡蘿卜素(ψ,ψ-carotene)，分子式為C40H56，相對分子質量為536.85。番茄紅素的分子由多聚烯鏈構成，含11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵，末端無芳香環(huán)，為開環(huán)結構。由于分子中存在多個雙鍵，番茄紅素普遍存在幾何異構現(xiàn)象。天然來源的番茄紅素主要以全反式(all E-isomer)的形式存在(圖1)，是最穩(wěn)定的一種構型。在目前的研究工作中，反式異構體的性質是關注的重點[1-4]。

超臨界流體是物質處于臨界壓力和臨界溫度之上的一種狀態(tài)。超臨界流體技術(包括超臨界流體萃取和色譜)已被大量應用于類胡蘿卜素的制備和分析上[5-6]。由我國新疆紅帆生物科技有限公司研發(fā)的世界上第一條應用超臨界CO2為第一萃取溶媒從番茄果皮中萃取天然番茄紅素的生產(chǎn)線在我國新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州已經(jīng)運行了6年[7]。以番茄紅素為功能因子的保健食品和食品添加劑產(chǎn)品在我國市場上呈暢銷趨勢。在這些應用中，類胡蘿卜素的檢測主要依靠其在紫外-可見區(qū)的吸收光譜(電子吸收光譜)。因此，研究超臨界流體溶媒對類胡蘿卜素(尤其是番茄紅素)電子吸收光譜的影響具有十分現(xiàn)實的意義。

在這一領域的研究始于20世紀90年代初期，由惠伯棣等[8]報道。到目前為止，惠伯棣等[1,2,6,8]所報道的結果包括:1)在超臨界CO2中，番茄紅素和β-胡蘿卜素的最大吸收波長較其在有機溶劑中的小；2)二者的最大吸收波長與CO2密度呈正相關；3)二者的躍遷能與CO2的極化率呈負線性相關[9]。在方法上，由惠伯棣等進行的番茄紅素在超臨界CO2流體中電子吸收光譜的研究工作均使用的是流動檢測設備。與使用靜態(tài)電子吸收光譜收集設備的方法相比，這種方法所需的設備較為普及，一般耐高壓的液相色譜檢測器即可。所得數(shù)據(jù)重復性較好，經(jīng)統(tǒng)計學分析后具有較好的置信度。

本項研究的目的為:根據(jù)在超臨界CO2色譜上測定的CO2流動相密度與全反式番茄紅素組分峰面積的相關性，推算CO2密度變化對全反式番茄紅素的吸光系數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DSM redivivoTM全反式番茄紅素樣品(番茄紅素含量≥10%) 瑞典帝斯曼公司。該產(chǎn)品為人工合成全反式番茄紅素的微結晶油懸浮物，含有少量的α-生育酚。使用前應用UV-Vis法對其中總番茄紅素含量進行標定[10]，標定含量為質量分數(shù)10.03%。隨后應用C30-HPLCPDA對其幾何異構體組成進行了分析[4,11]。分析結果表明:該樣品中全反式異構體的含量超過97%。

CO2(純度為99.9%) 北京氣體公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國迪馬公司；二氯甲烷、正己烷、N,N-二異丙基乙胺(分析純) 美國JK化學品公司。

1.2 儀器與設備

圖2 超臨界CO2流體色譜儀Fig.2 Flow chart of supercritical carbon dioxide fluid chromatography

超臨界流體色譜設備(該系統(tǒng)由CO2源、CO2泵、夾帶劑泵、進樣器、紫外-可見光檢測器(具掃描功能)、尾壓閥及控制器和數(shù)據(jù)采集設備組成，詳見圖2)、HPLC設備(PU-2080 Plus智能輸送泵、CO2輸送泵PU-1580-CO2、尾壓控制器BP-1580-81、檢溫箱CO-2065 Plus)日本分光(Jasco)公司、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站 浙大智達公司；Diamonsil C8色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)美國迪馬公司。Multi Spec-1501紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Waters PDA-2996二極管陣列檢測器 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的配制

將樣品在開啟前置于40℃水浴中15min，并不時搖動，使樣品具有一定流動性。開封后迅速稱取0.1775g樣品于10mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成0.01775g/mL的樣品儲備液。儲備液貯存于－80℃冰箱中，于48h內使用完畢。根據(jù)各實驗的需要用貯備液配制成不同質量濃度的工作液。

1.3.2 色譜操作

1.3.2.1 超臨界流體色譜

由于樣品中番茄紅素的含量僅為10%，因此，在采集組分的電子吸收光譜前，需經(jīng)過色譜的分離和純化過程，以確保組分在被收集光譜時處于純度較高的狀態(tài)。同時，在采集樣品組分的光譜時，組分的溶媒也必須單一，為超臨界態(tài)的CO2。否則，組分的吸光強度會受到干擾。因此，在采集光譜前，使用了C8固定相對組分進行了超臨界流體色譜純化。組分的色譜純化及光譜采集過程操作如下:關閉閥門-2，打開閥門-1，打開氣瓶閥門。打開C O2泵的制冷機電源，等待約30min，待綠色指示燈亮后，打開所有設備的電源。設定柱溫箱溫度為45℃，開啟反壓閥。約10min后，系統(tǒng)中空氣排盡。隨后，設定CO2泵的流速為2mL/min，反壓閥調控方式為恒流模式。在所有的實驗中，樣品導入體積均為20mL。

在色譜柱載量測定中，設定壓力為13MPa，柱溫箱溫度為45℃。根據(jù)之前研究[8-9]，檢測波長設定為453nm。

在壓力變化研究中，設定壓力分別為11.5、13、14.5、16、17.5MPa，柱溫箱溫度為45℃。檢測波長設定為453nm。樣品導入量為1.2μg。

在溫度變化研究中，設定壓力為13MPa，柱溫箱溫度分別為35、40、45、50、52℃。檢測波長設定為453nm。樣品導入量為1.2μg。

1.3.2.2 高壓液相色譜

色譜條件:流速:0.7mL/min；溫度:室溫25℃；流動相:乙腈-甲醇-二氯甲烷-正己烷-N-乙基-迪索丙胺(850:100:25:25:0.5，V/V)；檢測波長:470nm；樣品導入量:1.2μg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜系統(tǒng)在使用前用番茄紅素樣品進行重復性測試，6次進樣中番茄紅素組分峰面積的RSD≤3%。在實驗中，每個樣品重復進樣3次以上，直到采集到RSD小于3%的平行數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 全反式番茄紅素的超臨界CO2色譜行為

Jasco UV 2705 Plus Intelligent UV-Vis型檢測器具有進行實時光譜掃描的功能。因此，全反式番茄紅素組分的超臨界CO2色譜行為如圖3所示。

圖3 全反式番茄紅素組分的超臨界二氧化碳色譜行為Fig.3 Supercritical carbon dioxide chromatographic profile of alltrans lycopene fraction

2.2 壓力變化對保留時間的影響

圖4 壓力變化對全反式番茄紅素組分保留時間的影響Fig.4 Effect of pressure on retention time of all-trans lycopene fraction

由圖4可知，當CO2流動相的壓力自11.5MPa升至17.5MPa時，全反式番茄紅素組分在453nm波長處的保留時間呈縮短趨勢。

2.3 溫度變化對保留時間的影響

圖5 溫度變化對全反式番茄紅素組分保留時間的影響Fig.5 Effect of temperature on retention time of all-trans lycopene fraction

由圖5可知，當CO2流動相的溫度自32℃升至52℃時，全反式番茄紅素組分在13MPa壓力和453nm波長處的保留時間呈延長趨勢。

2.4 密度變化對保留時間的影響

由于超臨界CO2流體的壓力和溫度變化會引起其密度的變化，可根據(jù)全反式番茄紅素組分在453nm波長處的保留時間與CO2壓力和溫度變化的相關性(圖4、5)，得到組分保留時間與CO2密度變化的相關性(圖6)。

圖6 CO2密度變化對全反式番茄紅素組分保留時間的影響Fig.6 Effect of carbon dioxide density on retention time of all-trans lycopene fraction

2.5 色譜柱的最小檢測限、載量與線性測定

在壓力為13MPa、溫度為45℃、流速為2mL/min、檢測波長為453nm、進樣體積為20μL時，本色譜系統(tǒng)的全反式番茄紅素最小檢出量為60ng。

本項研究的目的是在色譜系統(tǒng)上根據(jù)組分的峰面積推算全反式番茄紅素的吸光系數(shù)，并觀察色譜流動相條件的變化對吸光系數(shù)的影響。因此，樣品進樣量與組分峰面積的線性相關是保證實驗結果準確性的必要條件。由圖7可知，當樣品量在0～11.836μg時，樣品進樣量與組分峰面積可以被認為呈線性相關(R2＝0.9967)。色譜柱的載量值＞15μg。

圖7 樣品進樣量對全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.7 Effect of sample loading amount on fraction peak area

2.6 壓力變化對峰面積的影響

圖8 壓力變化對全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.8 Effect of pressure on fraction peak area

在以下的實驗中，進樣量均為1.2μg，小于色譜柱的載量，以保證樣品量與組分峰面積的線性關系。由圖8可知，當CO2流動相的壓力自11.5MPa升至17.5MPa時，全反式番茄紅素組分在453nm波長的峰面積呈增加趨勢。

2.7 溫度變化對峰面積的影響

圖9 溫度變化對全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.9 Effect of temperature on fraction peak area

由圖9可知，當CO2流動相的溫度自32℃升至55℃時，全反式番茄紅素組分在453nm波長的峰面積呈減少趨勢。

2.8 CO2密度變化對峰面積的影響

如上所述，超臨界CO2流體的壓力和溫度變化可引起其密度的變化。根據(jù)全反式番茄紅素組分在453nm波長處的峰面積與CO2流動相壓力和溫度變化的相關性(圖8、9)，其峰面積與CO2密度變化的相關性見圖1 0。

圖10 CO2密度變化對全反式番茄紅素組分峰面積的影響Fig.10 Effect of CO2 density on fraction peak area

由圖10可知，在0.53～0.75g/mL范圍內，當超臨界CO2密度增加時，其中全反式番茄紅素組分的峰面積呈增加趨勢。本項研究所得數(shù)據(jù)表明:關于超臨界CO2密度與組分峰面積的數(shù)量相關性尚不能確定。但在這個密度范圍內，其R2＝0.9075。如要確定二者的關系，需擴大檢測密度的范圍。即使如此，在本項研究中，亦可根據(jù)所得二者的線性關系推算了在不同CO2密度條件下的全反式番茄紅素組分吸光系數(shù)。

2.9 全反式番茄紅素組分在HPLC流動相中的吸光系數(shù)測定與計算

在本項研究中，也對1.2μg全反式番茄紅素組分在乙腈為主的流動相(乙腈體積分數(shù)85%)中的峰面積進行了測定。隨后，在UV-Vis上，根據(jù)惠伯棣等[8]報道的方法，測定了該組分在流動相中的值為3430。

雖然根據(jù)本項實驗的結果，超臨界CO2密度與組分峰面積的數(shù)量相關性尚不能確定。但在這個密度范圍內，線性回歸方程為:

式中:x為超臨界CO2密度/(g/mL)；y為全反式番茄紅素組分峰面積/(mV·s)。

其中:R2＝0.9075。在本項研究中，根據(jù)所回歸的線性關系按式(2)推算全反式番茄紅素組分在密度為0.53～0.75g/mL范圍內超臨界CO2流體中的吸光系數(shù)結果見表1。

式中:ASF為全反式番茄紅素組分在超臨界CO2流體中的吸光系數(shù)AHPLC為全反式番茄紅素組分在HPLC流動相中的吸光系數(shù)(A)；SSF為全反式番茄紅素組分在超臨界CO2流體中的峰面積/(mV·s)；SHPLC為全反式番茄紅素組分在H PLC流動相中的峰面積/(mV·s)。

表1 溶媒密度變化對全反式番茄紅素吸光系數(shù)化的影響Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

表1 溶媒密度變化對全反式番茄紅素吸光系數(shù)化的影響Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

溶媒名稱密度/(g/mL)吸光系數(shù)(A1cm)狀態(tài)HPLC流動相0.7903430液態(tài)0.7572238超臨界態(tài)0.7502221超臨界態(tài)0.7272165超臨界態(tài)超臨界CO20.6992098超臨界態(tài)0.6912078超臨界態(tài)0.6441964超臨界態(tài)0.5861823超臨界態(tài)0.5781804超臨界態(tài)1%

3 結 論

本項研究的結果表明:全反式番茄紅素組分在超臨界CO2色譜中最大吸收波長下的峰面積是可變的，與CO2密度呈線性正相關。由此，可以得出結論:全反式番茄紅素的吸光系數(shù)與超臨界CO2流體密度變化呈線形正相關。

[1]惠伯棣. 類胡蘿卜素化學與生物化學[M]. 北京: 中國輕工出版社, 2005: 261-266.

[2]惠伯棣, 朱蕾, 歐陽清波, 等. 類胡蘿卜素的命名[J]. 中國食品添加劑, 2003(4): 48-54.

[3]李京, 惠伯棣, 裴凌鵬. 番茄紅素: 被關注的功能因子[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 461-464.

[4]李京, 惠伯棣. 番茄紅素在體內代謝中的幾何異構體組成變化[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 591-594.

[5]FAVATI P, KING J W, FRIEDRICH J P, et al. Supercritical CO2 extraction of carotene and lutein from leaf protein concentrate[J]. Food Science, 1988, 53(5): 1532-1536.

[6]惠伯棣. 胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素在反相超臨界色譜中的分離初探[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 162-166.

[7]龐善春, 惠伯棣, 劉沐霖. 天然番茄紅素軟膠囊的生產(chǎn)工藝和質量控制點分析[J]. 食品科學, 2007, 28(8): 619-624.

[8]HUI Bodi, YOUNG A J, BOOTH L A, et al. Detection of carotenoids on supercritical fluid chromatography (SFC). A preliminary investigation on the spectral shifts of carotenoids in supercritical carbon dioxide[J]. Chromatographic, 1994, 39(9/10): 549-556.

[9]惠伯棣. 超臨界CO2中全反式β,β-和ψ,ψ-胡蘿卜素的電子吸收光譜位移研究[J]. 食品科學, 2008, 29(10): 125-128.

[10]白鴻. 保健食品功能因子檢測[M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2011: 270-273.

[11]李京, 惠伯棣. 秋橄欖果實中番茄紅素含量與幾何異構體組成分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 27(10): 64-65.

Effect of Supercritical Carbon Dioxide Density on Absorption Coefficient of All-trans Lycopene

HE Qiang-qiang，HUI Bo-di*，GONG Ping (College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To assess the effect of varying carbon dioxide density on absorption coefficientof all-trans lycopene through exploring the correlation between carbon dioxide density in supercritical fluid chromatography (SFC) and peak areas of all-trans lycopene fractions. Methods: Supercritical CO2fluid chromatography was carried out on a Diamonsil C8(250mm × 4.6 mm, 5 μm, ) at a pressure ranging from 11.5 to 17.5 MPa, and a temperature ranging from 35—55 ℃. The detection wavelength was 453 nm, and 20 μL sample was injected for SFC chromatography. Results: Peak area of all-trans lycopene at the maximum absorption wavelength in supercritical carbon dioxide fluid chromatography revealed a variation and was linearly positive correlated with the density of carbon dioxide. Conclusion: Absorption coefficient of all-trans lycopene is positively correlated with the density of supercritical carbon dioxide.

all-trans lycopene；supercritical fluid chromatography (SFC)；supercritical carbon dioxide；density；absorption coefficient

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0052-05

2011-07-04

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAI58B06)；2010年北京聯(lián)合大學“創(chuàng)新人才建設計劃”項目(2010-05-20)

何強強(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為生物活性物質制備及天然產(chǎn)物化學。E-mail:8075874@163.com

*通信作者:惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學及生物化學。E-mail:bodi_hui@ygi.edu.cn