郎宇璜，陳鳳媛，繆京豐，席晨輝

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是嚴 重創(chuàng)傷導致死亡的主要原因之一，除原發(fā)損傷過于嚴重導致不可逆腦損傷外，其繼發(fā)的多器官功能障礙綜合征(MODS)也是導致死亡的主要原因。目前，有關TBI后胃腸功能障礙的研究多集中在營養(yǎng)不良和應激性潰瘍方面，而對于腸黏膜屏障(intestinal mucosa barrier，IMB)功能的應激性變化研究較少［1］。不同程度TBI后IMB應激反應是如何變化的?本實驗通過建立大鼠不同程度TBI模型，研究大鼠不同程度TBI后IMB的應激性變化趨勢，報道如下。

材料與方法

1 實驗動物分組及處理

健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠78只，體重200～250g，由復旦大學實驗動物科學部提供［SYXK(滬)2007-002］。將大鼠隨機分為正常對照組(n=6)、輕度 TBI組(n=24)、中度 TBI組(n=24)、重度TBI組(n=24)。輕、中、重度TBI組根據(jù)傷后3、12、24、72h 時相各分為 4 個亞組(T3、T12、T24、T72 時相組)，每組 6 只。參照 Feeney’s［2］自由落體硬膜外撞擊方法建立輕、中、重度TBI模型［3］。正常對照組及T3、T12、T24、T72時相組大鼠用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔內注射麻醉后，打開腹腔，腹主動脈取血置于抗凝管，無菌技術抽取大鼠門靜脈血入無熱原抗凝管中，3 000r/min離心5min，分離血漿并凍存于－70℃冰箱，集中檢測血漿D-乳酸(D-LAC)、內毒素(ET)水平，二胺氧化酶(DAO)活性。取回腸末段(距回盲部5cm)組織約1cm用10%的中性甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，封片。光學顯微鏡(Olympus CS-31)下觀察腸黏膜組織形態(tài)變化。

2 檢測指標及方法

病理評分方法:采用 chiu’s法［4］評分進行回腸黏膜損傷指數(shù)(MDI)測定。D-LAC測定方法:采用改良酶聯(lián)紫外分光光度法檢測［5］，試劑由上海杰美基因公司提供，結果以mmol/L表示。ET測定方法:采用改良基質偶氮顯色鱟試驗法測定［6］，檢測試劑盒由廈門鱟試劑廠提供，結果以Eu/ml表示。DAO測定方法:采用分光光度法檢測［7］，試劑由南京建成生物工程有限公司提供，結果以u/ml表示。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 腸黏膜組織學改變

光鏡下對照組回腸黏膜結構完整，絨毛上皮無缺損，偶可見少量炎性細胞浸潤。重度TBI組:傷后3h腸黏膜絨毛上皮腫脹、頂端部分破損或斷裂。傷后12h絨毛上皮成塊脫落，黏膜固有層充血、水腫伴炎性細胞浸潤。傷后24h絨毛壞死脫落、形成缺損，造成固有層裸露。傷后72h上述損傷更加明顯，出現(xiàn)黏膜厚度變薄，固有層崩解。輕、中度TBI組:在傷后24h腸黏膜組織出現(xiàn)變化但程度較輕。各組動物不同時間回腸組織chiu’s法評分的比較:重度TBI組傷后3～72h MDI均明顯高于對照組、輕、中度 TBI組(P＜0.01)，輕、中度 TBI組傷后 24h MDI高于對照組(P ＜0.05，P ＜0.01)，傷后72h輕度TBI組MDI與對照組無明顯差異，中度TBI組MDI仍高于對照組(P＜0.01)(圖1)。

圖1 各組大鼠不同時間回腸組織chiu’s法評分的比較(n=6)

2 血漿D-LAC水平變化

中、重度TBI組D-LAC在傷后3h即明顯升高，傷后24h達到高峰，傷后72h略降低，但仍然明顯高于對照組和輕度TBI組，其中重度TBI組升高更加明顯。輕度TBI組D-LAC僅在傷后24h一度升高，傷后72h與對照組無明顯差異(圖2)。

圖2 各組大鼠不同時間血漿D-LAC的比較(n=6)

3 門靜脈血ET水平變化

重度TBI組ET水平在傷后3h即明顯升高，后略有降低，傷后72h再次升高，呈雙峰形。中度TBI組ET水平在傷后3h即開始升高，傷后24h達到高峰，傷后72h仍維持較高水平。輕度TBI組ET水平僅在傷后24h一度升高，傷后72h與對照組無明顯差異(圖3)。

圖3 各組大鼠不同時間ET水平的比較(n=6)

4 血漿DAO活性變化

重度TBI組DAO在傷后3h即明顯升高，傷后12h達到高峰，后逐漸降低，但傷后72h仍然明顯高于對照組和輕、中度TBI組。中度TBI組DAO在傷后12h、24h明顯升高，傷后72h迅速回落，與對照組無明顯差異。輕度TBI組DAO活性僅在傷后24h一度升高，傷后72h與對照組無明顯差異(圖4)。

圖4 各組大鼠不同時間血漿DAO活性的比較(n=6)

討 論

嚴重創(chuàng)傷等應激狀態(tài)下極易導致IMB的應激性損傷，從而導致ET和腸道細菌移位并入血，隨后激活靶細胞，觸發(fā)次級或多級新生介質，導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至發(fā)生 MODS［8］。大鼠TBI后腸黏膜結構和屏障功能的損害可能與內臟血流灌注減少、腸黏膜血流量的下降［1，9］使腸黏膜處于低灌注狀態(tài)及隨后發(fā)生的再灌注損傷、細胞因子介導的炎性反應［10］、氧自由基［11］等因素有關。

由于末段回腸組織既具有小腸應激反應強烈的特點，又因臨近大腸而腸腔中ET和細菌含量較高，因此是觀察IMB應激性變化和細菌移位的較理想部位［8］，本實驗中大鼠重度TBI組傷后3h光鏡下即可見回腸黏膜絨毛上皮腫脹、頂端部分破損或斷裂，后逐漸出現(xiàn)黏膜局灶糜爛、壞死，固有層裸露，黏膜厚度變薄等病理變化。輕、中度TBI組在傷后24h腸黏膜組織學出現(xiàn)變化。說明重度TBI時回腸組織應激反應出現(xiàn)早，持續(xù)時間長，腸黏膜結構損傷程度嚴重。

D-LAC是細菌代謝和裂解的產(chǎn)物，哺乳動物組織既不產(chǎn)生D-LAC，體內也無快速降解它的系統(tǒng)，正常情況下血中水平很低，當腸通透性異常升高時，腸道細菌產(chǎn)生的大量D-LAC透過腸黏膜進入門靜脈循環(huán)。肝臟不能代謝D-LAC，外周血與門靜脈血中D-LAC濃度十分接近，因此D-LAC濃度的增加間接反映了IMB的功能狀態(tài);Evennett等［12］認為血中D-LAC水平可及時反映腸黏膜損害和通透性變化。本實驗結果表明:輕度TBI組D-LAC僅在傷后24h一度升高;而中、重度TBI組D-LAC在傷后3h即明顯升高，傷后24h達到高峰，傷后72h仍然明顯高于對照組和輕度TBI組。傷后早期D-LAC濃度升高反映了IMB功能損傷，后期D-LAC濃度持續(xù)升高說明IMB功能損傷持續(xù)存在，同時也可能與腸道菌群過度繁殖有關。

在嚴重創(chuàng)傷后機體免疫力下降等情況下，腸道內致病菌特別是革蘭氏陰性菌大量繁殖并釋放大量ET，可造成腸黏膜細胞支架破損［13］，導致 IMB損傷。由于ET分子明顯小于細菌，即使腸黏膜通透性輕微增加，ET也可通過IMB經(jīng)門靜脈進入肝臟入血。因此，血漿ET水平的變化可間接反映機體IMB的功能狀態(tài)［14］。本實驗中輕度TBI組ET僅在傷后24h一度升高;中度TBI組ET在傷后3h即開始升高，傷后24h達到高峰，傷后72h仍維持較高水平;重度TBI組ET在傷后3h即明顯升高，后略有降低，傷后72h再次升高，呈雙峰形。第1個峰值可能與交感神經(jīng)興奮，內臟短暫缺血導致的急性腸黏膜損害有關。隨著肝解毒功能的恢復和抗ET抗體的產(chǎn)生，血漿ET水平有所下降［15］。傷后72h的第2個峰值可能與腸黏膜上皮細胞壞死和局灶性黏膜潰瘍有關［16］，反映了重度TBI時IMB損傷程度嚴重且持續(xù)時間長。

血漿中D-LAC和ET水平的升高只是間接反映腸損傷，而血中DAO來源腸黏膜上皮細胞，其活性增加與細胞受損后的膜通透性升高及細胞壞死、脫落有關，能更直接地反映腸黏膜上皮細胞及其構成的腸屏障結構的受損情況［17］。本實驗結果表明:重度TBI組DAO在傷后3h即明顯升高，傷后12h達到高峰，后逐漸降低，但傷后72h仍然明顯高于對照組、輕、中度 TBI組。中度 TBI組 DAO在傷后24h、12h升高，但傷后72h迅速回落，與對照組無明顯差異。一方面可能是輕度TBI腸黏膜上皮細胞損傷呈一過性;另一方面可能是中、重度TBI傷后早期腸黏膜上皮細胞被激活釋放出大量的DAO進入循環(huán)導致血中DAO升高，此后由于腸黏膜上皮的功能部細胞非常嬌嫩，腸黏膜低灌注狀態(tài)、缺血-再灌注損傷、細胞因子和炎性遞質等作用導致其壞死脫落，導致血中 DAO 下降［18］。

本研究表明，反映腸黏膜通透性變化的指標血漿D-LAC、ET水平和反映腸黏膜上皮細胞受損情況的血漿DAO活性變化趨勢與小腸黏膜病理變化相一致，證實大鼠輕度TBI傷后24h存在一過性腸黏膜上皮結構損傷和屏障功能損害，傷后72h基本恢復。大鼠中、重度TBI可造成比輕度TBI更為嚴重的腸黏膜上皮結構損傷和屏障功能損害，且出現(xiàn)時間早、持續(xù)時間長。說明大鼠對不同程度的TBI所產(chǎn)生的應激反應程度不同，對IMB的影響程度和持續(xù)時間也不相同。

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