方紅波，張水軍#，張 明，郭文治，張建軍，趙永福

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科;河南省肝移植中心;河南省高等學(xué)校肝膽胰外科與消化器官移植重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室鄭州450052 2)上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院器官移植中心上海200127

膽管梗阻性黃疸是肝膽外科常見癥狀，可見于膽總管結(jié)石、膽管癌、胰頭癌等疾病。若梗阻得不到及時(shí)解除，可引發(fā)急性肝功能衰竭、膽汁性肝硬化等。約8%的梗阻性黃疸患者在圍手術(shù)期發(fā)生急性腎功能衰竭，發(fā)生急性腎功能衰竭后約68%的患者死亡［1］。缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)急性腎功能衰竭。以往的研究［2-4］多關(guān)注于膽管梗阻對(duì)肝臟的影響，作者建立小鼠膽總管短暫梗阻(transient common bile duct obstrnction，TCBDO)模型和腎臟缺血再灌注(kidney ischemia-reperfusion，KIR)模型，觀察 TCBDO對(duì)腎臟和KIR的影響。

1 材料與方法

1.1 TCBDO模型的制備 用60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射誘導(dǎo)麻醉小鼠，腹正中切口打開腹腔，暴露出肝門，用7-0帶針線縫扎膽囊管，并在胰腺上方打一活結(jié)，結(jié)扎膽總管，將松線端埋于皮下，雙層關(guān)腹。術(shù)后第2天將結(jié)扎線松開。膽總管結(jié)扎假手術(shù)(SHAM)不結(jié)扎膽總管，其余操作步驟同上。

1.2 KIR模型的制備 用60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，將小鼠置于動(dòng)物恒溫系統(tǒng)的加熱板上，置溫度感應(yīng)探頭于肛門，維持體溫(36.0±0.5)℃。腹正中切口打開腹腔，將右側(cè)腎臟切除，游離出左側(cè)腎蒂，腹腔注射肝素鈉50 U/kg，用無損失微血管夾夾閉腎蒂25 min后，移去血管夾，然后雙層關(guān)腹，皮下注射0.5 mL生理鹽水，24 h后取血和腎標(biāo)本。

1.3TCBDO后小鼠血清總膽紅素(TB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和肌酐(Cr)水平的變化 取清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只，年齡8～12周，體質(zhì)量20～28 g，自由進(jìn)食水，制備TCBDO模型，術(shù)后第0、1、2、3、4 及 5 天，腹主動(dòng)脈抽血約1 mL，分離血清測(cè)TB、ALT和Cr;并于術(shù)后第3、4及5天，取腎臟測(cè)HSP27蛋白的表達(dá)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠。以SHAM后第4天小鼠為對(duì)照。

1.4 TCBDO對(duì)小鼠KIR影響的觀察 另取40只小鼠，將按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只。SHAM+NOIR組:行SHAM且不做 KIR，于 SHAM后第4天抽血留標(biāo)本;TCBDO+NOIR組:行TCBDO造模術(shù)不做KIR，第4天抽血留標(biāo)本;SHAM+KIR組:行SHAM術(shù)后第4天行KIR造模術(shù)，缺血25 min灌注24 h后抽血留標(biāo)本;TCBDO+KIR組:TCBDO造模術(shù)后第4天行KIR術(shù)，缺血25 min再灌注24 h后抽血留標(biāo)本。血標(biāo)本用于血清Cr水平測(cè)定。抽血后切取腎臟，用于HSP27蛋白、組織形態(tài)學(xué)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)觀測(cè)方法

1.5.1 血清生化指標(biāo)測(cè)定 采用西門子德靈自動(dòng)生化儀測(cè)血清TB、ALT及Cr。

1.5.2 腎臟HSP27的表達(dá) 腎臟留取后凍存。用NE-PER核和胞質(zhì)蛋白提取試劑(Thermo Scientific)提取總蛋白，使用100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加兔抗鼠HSP27多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗β-actin小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)公司)，二抗為抗兔、抗鼠多克隆抗體(Licor公司)。以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 腎臟標(biāo)本于中性甲醛中過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，行過碘酸雪夫(PAS)染色。以半定量組織病理評(píng)分評(píng)估腎組織變化:正常為0分;異常變化＜25%計(jì)為1分;異常變化占25% ～為2分;50% ～為3分;75%～為4分。每個(gè)切片至少觀察3個(gè)視野(×400)。

1.5.4 腎臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度測(cè)定 采用髓過氧化物酶(MPO)法檢測(cè)。試劑購自Novus Biologicals公司。陽性細(xì)胞有棕黃色顆粒。每個(gè)切片至少觀察3個(gè)無重疊視野(×400)，根據(jù)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值評(píng)估中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

1.5.5 腎臟細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用TUNEL法檢測(cè)，試劑購自Chemicon International公司。凋亡細(xì)胞呈棕褐色。每個(gè)切片至少觀察3個(gè)無重疊視野(×400)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，以平均值評(píng)估細(xì)胞凋亡程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)，不同時(shí)間點(diǎn)TCBDO小鼠血清 TB、Cr、ALT及 HSP27蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn);4組小鼠腎組織病理評(píng)分和MPO陽性細(xì)胞數(shù)的比較采用非正態(tài)分布數(shù)據(jù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較4組小鼠血清Cr水平及腎組織凋亡細(xì)胞數(shù);檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1TCBDO 后小鼠血清 TB、ALT、Cr水平的變化TCBDO后各時(shí)間點(diǎn)小鼠血清TB、ALT、Cr測(cè)定結(jié)果見表1?？梢钥闯?，TCBDO后小鼠血清TB和ALT水平快速上升，此后迅速降低;血清Cr水平變化不大。

表1 TCBDO后小鼠血清TB、Cr、ALT的水平

2.2 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達(dá)TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白表達(dá)增強(qiáng)，見圖1和表2。

圖1 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達(dá)

表2 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達(dá)

2.3 TCBDO對(duì)小鼠KIR后血清Cr水平的影響見表3。

表3 TCBDO+KIR對(duì)小鼠血清Cr水平的影響(n=10)

2.4 TCBDO對(duì)小鼠KIR后腎組織的影響 見圖2。SHAM+KIR組:高倍鏡下可見廣泛的腎小管上皮細(xì)胞壞死，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腔內(nèi)可見管型和壞死脫落的細(xì)胞，腎間質(zhì)血管高度擴(kuò)張充血，可見灶性出血，腎組織病理評(píng)分為(3.20 ±0.58)。TCBDO+KIR組:損傷程度減輕，大片壞死區(qū)明顯減少，僅見局灶性小管壞死，很少見管型和壞死細(xì)胞，間質(zhì)充血、出血明顯減輕，腎組織病理評(píng)分為(2.10±0.52)。SHAM+NOIR組和TCBDO+NOIR組腎組織表現(xiàn)正常，腎組織病理評(píng)分均為(0.00±0.00)。4組腎組織病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=14.545，P=0.002)，TCBDD+KIR 組較 SHAM+KIR組明顯降低。

圖2 4組小鼠腎臟組織學(xué)表現(xiàn)(PAS染色，×400)

2.5 TCBDO對(duì)小鼠KIR后腎組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 MPO染色結(jié)果見圖3。SHAM+NOIR和TCBDO+NOIR組MPO陽性細(xì)胞數(shù)均為(0.00±0.00)，SHAM+KIR 和 TCBDO+KIR 組分別為(42.0 ±11.0)和(15.0 ±5.0)，4 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=14.545，P=0.002)，TCBDO+KIR組較SHAM+KIR組明顯降低。

圖3 4組小鼠腎組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況(MPO染色，×400)

2.6 TCBDO對(duì)小鼠KIR后腎組織細(xì)胞凋亡的影 響 結(jié)果見圖4和表4。

圖4 4組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

表4 TCBDO+KIR對(duì)小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

膽總管梗阻可引起血清膽紅素升高。大量數(shù)據(jù)證實(shí)，膽紅素具有抗氧化和保護(hù)細(xì)胞的作用。微量的膽紅素可以減輕大鼠離體心臟的缺血再灌注損傷［4］。用膽紅素沖洗大鼠移植肝臟，能改善移植后肝臟的急性氧化應(yīng)激和肝膽管功能障礙［5］。在內(nèi)皮細(xì)胞中，膽紅素還可以抑制腫瘤壞死因子α激活核因子κB和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)［6］。該實(shí)驗(yàn)中，小鼠膽總管短暫梗阻(TCBDO)術(shù)后血清TB、ALT水平先快速升高，后迅速下降，至術(shù)后第4天已降到正常水平;而血清Cr水平未發(fā)生明顯變化。因而，該實(shí)驗(yàn)中，作者選擇在TCBDO術(shù)后第4天行KIR造模術(shù)，因此可忽略血清膽紅素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

KIR損傷的一個(gè)重要特征就是中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn);中性粒細(xì)胞通過ICAM-1和P-選擇素連接于血管內(nèi)皮細(xì)胞，透過內(nèi)皮細(xì)胞間隙游走到腎臟組織間隙;中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的蛋白酶、細(xì)胞因子、活性氧和氮化物可對(duì)腎組織產(chǎn)生損傷［7］。該研究結(jié)果顯示，TCBDO后第4天行KIR，小鼠血清Cr水平、腎組織病理評(píng)分和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度較單獨(dú)KIR術(shù)后明顯降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡也明顯減少，說明TCBDO可減輕小鼠KIR損傷。HSP27是小分子熱休克蛋白，可由缺氧、缺血、高溫等各種應(yīng)激因素誘導(dǎo)而高表達(dá)，以抵御應(yīng)激造成的傷害。HSP27具有分子伴侶、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用［8］。HSP27高表達(dá)的小鼠能更好地耐受腎臟、肝臟和心臟的缺血再灌注損傷［9-11］。該實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)，TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。熱應(yīng)激處理大量誘導(dǎo)的HSP27可阻礙大鼠心臟中血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-6(IL-6)和ICAM-1的表達(dá)，從而減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟炎癥反應(yīng)［12］。HSP27可通過P38-促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)刺激活化單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-10［13］。IL-10能抑制多種炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放，具有減輕KIR損傷的作用［14-15］。根據(jù)該研究結(jié)果，推測(cè)高表達(dá)的HSP27可能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，從而阻礙中性粒細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn);通過P38-MAPK途徑誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，減輕KIR損傷。

綜上所述，TCBDO影響了小鼠肝臟功能，并未影響到腎臟功能，而有可能作為誘導(dǎo)者，增強(qiáng)腎臟HSP27的表達(dá)，從而增強(qiáng)了腎臟抵抗傷害的能力。這可為防治梗阻性黃疸患者術(shù)后急性腎功能衰竭的發(fā)生提供參考，其明確的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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