高潤娣， 曹 婕，盧 珊， 應(yīng) 琳，高 璇， 陸國華，李和權(quán)， 周建英

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州 310003)

肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)內(nèi)襯于肺泡微血管內(nèi)壁，在多種肺部疾病的血管再生過程中起著重要作用［1］。本文報道一種簡單、重復(fù)性極好的PMVECs原代培養(yǎng)方法，并運用基質(zhì)膠(matrigel)體外二維小管形成實驗開展其體外功能研究。

材料和方法

1 主要試劑

RPMI－1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自PAA;胰蛋白酶購自Gibco;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購自PeproTech;兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(polyclonal rabbit anti－h(huán)uman factorⅧ －related antigen，ⅧF－Ag)購自DAKO;兔Ⅱ抗和DAB試劑盒購自北京中杉金橋;四甲基吲哚碳花青標記乙?；兔芏戎鞍?1，1'－dioctadecyl－3，3，3'，3'－ tetramethylindo － carbocynamina perchlorate labeled acetylated low－density lipoprotein，DiI－Ac－LDL)購自Invitrogen;異硫氰酸熒光素標記的異植物血凝素(fluorescein isothiocyanate－labeled Bandeiraea simplicifolia lectin I，F(xiàn)ITC －BSI)購自 Vector Laboratories;基質(zhì)膠(matrigel)購自BD;明膠(gelatin)購自Sigma。

2 方法

2.1 小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

2.1.1 原代培養(yǎng) 取小于1周齡的健康C57BL/6小鼠，斷頸處死后置75%乙醇中浸泡3～4 min。在無菌操作臺剪開胸腔，自右心室心尖處進針緩慢推注0.3 mL RPMI－1640液沖凈肺循環(huán)血液。用微型鑷輕輕剝離臟層胸膜，將肺組織的邊緣部分剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊后轉(zhuǎn)移至盛有1 mL胎牛血清的培養(yǎng)皿中，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min(37℃、5%CO2)。隨后，將組織塊(10塊/孔)均勻貼入1%明膠包被的24孔板，斜置于培養(yǎng)箱中固化45 min后加入200 μL RPMI－1640液(含20%胎牛血清、肝素 9×104U/L及雙抗)，8 h后再添加800 μL，隔天半量換液。60 h后將組織塊去除，以免成纖維細胞等混雜細胞遷出，并添加VEGF(5 μg/L)。當絕大多數(shù)區(qū)域的細胞長成致密細胞層時進行首次消化并重新鋪于原孔。

2.1.2 傳代培養(yǎng) 在細胞長滿孔板面積的70% ～80%時(原代細胞培養(yǎng)至第7 d左右)進行傳代:吸棄上清，DHanks液洗2次，加200 μL不含EDTA的0.25%胰酶消化3～4 min，加1 mL含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，移液器吹打混勻細胞后轉(zhuǎn)移至無菌離心管，210×g離心5 min，棄上清，用含VEGF的RPMI－1640液重懸，按1∶2比例(即將1個培養(yǎng)板孔的細胞平均分配至2個孔)傳代。

2.2 細胞鑒定

2.2.1 形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況。

2.2.2 Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫組化染色 分別以4%多聚甲醛固定細胞(4℃、15 min)、0.2%Triton X－100穿膜15 min以及羊血清封閉10 min，加入Ⅰ抗兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原(1∶50)，37 ℃孵育1.5 h，再加入Ⅱ抗羊抗兔 IgG，37 ℃孵育1 h，隨后進行DAB顯色、蘇木精復(fù)染，倒置顯微鏡下觀察。

2.2.3 FITC －BSI結(jié)合實驗以及 DiI－Ac－LDL攝取實驗第3代細胞每孔加入25 mg/L DiI－Ac－LDL，37℃孵育12 h后，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min后，每孔加入20 mg/L FITC－BSI，37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 PMVECs體外血管形成功能的研究

基質(zhì)膠置4℃冰箱過夜融化，以RPMI－1640培養(yǎng)基按2∶1稀釋，取50 μL均勻鋪于96孔板置細胞培養(yǎng)箱靜置(37℃，30 min)，待凝固后每孔逐滴緩慢加入200 μL PMVECs懸液(1×108cells/L)，提高 VEGF 濃度至10 μg/L，在倒置顯微鏡下觀察(2 h 1次)其24 h體外血管形成過程。

結(jié) 果

1 形態(tài)學觀察

組織塊貼于培養(yǎng)板24 h后鏡下即見少量PMVECs爬出，60 h后則在90%以上的組織塊周圍分布。至第4～5 d，細胞區(qū)域性生長密集，第7 d時內(nèi)皮細胞生長均勻，融合成單層，多呈短梭形、多角形，為典型鋪路石樣排列，見圖1。

Figure 1.Phase－contrast micrograph of PMVECs(×200).Primary PMVECs are polygonal and fusiform with clear boundaries and show a cobblestone－like appearance.圖1 原代培養(yǎng)的小鼠PMVECs

2 細胞鑒定

2.1 Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫組化染色 Ⅷ因子相關(guān)抗原表達陽性，鏡下可見細胞胞質(zhì)和核膜周圍呈棕黃色顆粒，見圖2。

Figure 2.Identification of mouse PMVECs for factorⅧ －related antigen(×100).The expression of factorⅧ －related antigen of PMVECs is positive，and their cytoplasm is typically stained brown－yellow.圖2 小鼠PMVECs的Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定

2.2 FITC－BSI結(jié)合實驗以及DiI－Ac－LDL攝取實驗 熒光顯微鏡下可見大部分細胞攝取DiI－Ac－LDL，胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光，細胞表面與FITC－BSI結(jié)合，呈現(xiàn)黃綠色熒光，見圖3。

3 體外血管形成

PMVECs(純度大于90%)接種于基質(zhì)膠后，在2 h內(nèi)即可貼壁、黏附，4～6 h形成分散的網(wǎng)狀及管腔結(jié)構(gòu)，管腔周圍聚集單層細胞，其數(shù)量逐漸增多。10～12 h后，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相互交通、連接似“蜂窩狀”，隨后管腔結(jié)構(gòu)逐漸減少，見圖4。

Figure 3.Identification of mouse PMVECs by immunofluorescent method(×200).Positive immunoreactivity for binding with FITC－BSI(green)is shown as well as uptake of DiI－Ac－LDL(red)by PMVECs.圖3 小鼠PMVECs的免疫熒光鑒定

討 論

自從Jaffe等［2］首次體外成功培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞以后，血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)技術(shù)不斷改進，目前主要有酶消化法、組織塊法等。其中，組織貼塊法因操作簡便、對細胞損傷較小、獲得細胞活力強而廣為大家采用。本文綜合多種組織貼塊法［3－4］，并對許多細節(jié)做了改進:(1)選用出生1周以內(nèi)的小鼠肺組織［3］，其細胞的增殖能力較成年小鼠旺盛，爬出的細胞在短時間內(nèi)即能長成單層致密層。(2)實驗前小鼠予以肝素化以便灌洗去除肺循環(huán)血液，避免血細胞影響PMVECs的遷出。(3)組織塊貼壁牢固與否非常關(guān)鍵，故我們采用1%明膠預(yù)處理24孔板，并將肺組織塊置于含少許血清(可增強組織塊的黏附性)的培養(yǎng)皿中孵育45 min后再貼塊。傾斜放置培養(yǎng)板能夠減少組織塊的固化時間。在PMVECs原代培養(yǎng)過程中我們采取以下方法以減少混雜細胞的污染:(1)取邊緣肺組織(距游離緣﹤1.5 mm)以減少大血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的污染。(2)貼塊24 h后PMVECs開始游出，而成纖維細胞等混雜細胞在72 h后才爬出，故在貼塊60 h去除組織塊能保證大部分細胞為PMVECs。(3)采用含有肝素鈉與VEGF的培養(yǎng)基，前者不僅能提高PMVECs對VEGF的敏感性，而且可以抑制平滑肌細胞的生長［5］。(4)在PMVECs原代培養(yǎng)過程中，成纖維細胞污染最為常見，我們分別采用了細胞刮除法和差速消化法以去除獨立成片和散在分布的成纖維細胞。

Figure 4.Dynamic process of the tube formation of PMVECs plated on matrigel(×200).The cells initially attached in the first hour，then migrated toward each other and formed capillary－like tubes over the next 4～6 h，which matured at 10～12 h with a“honeycomb”appearance.After 16 h，the tubes detached from the matrix and broke apart.圖4 PMVECs體外血管形成的動態(tài)過程

體外管樣形成實驗是血管內(nèi)皮細胞在基質(zhì)膠上形成具有管腔的毛細管狀結(jié)構(gòu)，涉及內(nèi)皮細胞的黏附、遷移、蛋白酶活性和管樣形成等多個步驟，十分接近體內(nèi)血管新生的機制。該方法可用于促血管形成因子和拮抗因子的確定、參與血管形成的基因和信號通路的研究以及內(nèi)皮細胞或者內(nèi)皮祖細胞的鑒定［6］。與文獻報道一致，我們發(fā)現(xiàn)PMVECs接種4～6 h后出現(xiàn)明顯的管腔結(jié)構(gòu)，10～12 h呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，此后管腔結(jié)構(gòu)逐漸減少，一般認為，這是由于PMVECs發(fā)生凋亡所致［6］。諸多因素可影響該實驗的成敗，但最為關(guān)鍵的是PMVECs的狀態(tài)和數(shù)量。我們的經(jīng)驗是PMVECs傳代次數(shù)不超過5代，接種前臺盼藍檢測活細胞應(yīng)在95%以上;鋪板的PMVECs細胞數(shù)在5×104cells/cm2～6×104cells/cm2之間，否則會導(dǎo)致官腔形成數(shù)量過少、增厚或者細胞成片鋪展等問題。

綜上所述，我們建立了一種簡單有效，可重復(fù)性高的PMVECs原代培養(yǎng)方法，并成功構(gòu)建其體外血管形成模型，為今后進一步研究PMVECs的特性與生理功能及其在相關(guān)疾病過程中的作用奠定了方法學基礎(chǔ)。

［1］Duong HT，Erzurum SC，Asosingh K.Pro－angiogenic hematopoietic progenitor cells and endothelial colony－forming cells in pathological angiogenesis of bronchial and pulmonary circulation［J］.Angiogenesis，2011，14(4):411 －422.

［2］Jaffe EA，Nachman RL，Becker CG，et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria［J］.J Clin Invest，1973，52(11):2745 －2756.

［3］趙 軍，路 靜，趙繼敏，等.新生小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和抗原制備［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2008，29(20):1903 －1906.

［4］肖貞良，孫耕耘，錢桂生.肺循環(huán)灌注對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞分離和培養(yǎng)的影響［J］.中國病理生理雜志，1999，15(11):1053 －1054.

［5］Epstein H，Rabinovich L，Banai S，et al.Predicting in vivo efficacy of potential restenosis therapies by cell culture studies:species－dependent susceptibility of vascular smooth muscle cells［J］.Open Cardiovasc Med J，2008，2:60－69.

［6］Arnaoutova I，Kleinman HK.In vitro angiogenesis:endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract［J］.Nat Protoc，2010，5(4):628 － 635.