周國(guó)慶 唐 琴 楊明峰 黃 麗 孫保亮

(山東省高校腦微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東泰安 271000)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一組具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，此亞群為某些組成性表達(dá)CD25(IL-2受體α鏈)的CD4+T細(xì)胞。其可以分為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural Treg，nTreg)和獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(adaptive Treg，aTreg)，nTreg主要指胸腺髓質(zhì)T細(xì)胞發(fā)育成熟后進(jìn)入外周的Treg細(xì)胞，在預(yù)防病理性自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用;aTreg是由感染、移植、癌癥等抗原誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成，在感染和移植免疫等發(fā)揮重要作用［1］。由于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞約占正常人或大小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5% ～10%，由于其數(shù)量少，極大限制了其在多種疾病中的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)近年發(fā)展較快的免疫磁性分選技術(shù)，應(yīng)用免疫磁珠兩步法分離純化大鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行流式檢測(cè)和細(xì)胞活性檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重275～300 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞提取試劑盒、MagCellect磁性分離儀購(gòu)于 R＆D公司;Anti-rat CD4(APC)、Anti-rat CD25(PE)購(gòu)于eBioscience公司;HANK＇S培養(yǎng)液購(gòu)于Solarbio公司;FACS溶血素購(gòu)于BD Biosciences公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司;立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備

將大鼠麻醉過(guò)量處死，無(wú)菌取脾臟和淋巴結(jié)(頭頸部，腋窩，腹股溝等部位)，放入已高壓消毒的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入10 ml HANK＇S培養(yǎng)液;將其用磨砂玻璃片研磨，過(guò)100目濾網(wǎng)過(guò)濾轉(zhuǎn)至15ml的離心管中;1100 r/min離心5 min，去上清后加入5 ml FACS溶血素，混勻后靜置5 min;加入10 ml的PBS，1100 r/min離心8 min;去上清，加15 ml HANK＇S培養(yǎng)液離心洗滌一次，棄上清，用1×MagCellect Buffer將其懸浮，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108/ml。

1.3.2 陰性選擇CD4+T細(xì)胞后陽(yáng)性選擇CD4+CD25+T細(xì)胞

根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行磁性分選。首先陰性選擇CD4+T細(xì)胞，將2×108個(gè)細(xì)胞(2 ml)轉(zhuǎn)移到5 ml試管中，分別加入200 μl MagCellect CD4+T細(xì)胞抗體和250 μl MagCellect抗鼠IgG磁珠，依次輕輕混勻，分別在2～8℃孵育15 min;加入550 μl Buffer輕輕混勻，調(diào)整懸液體積至3 ml，將試管放于磁體中靜置10 min;當(dāng)試管在磁體中時(shí)用無(wú)菌移液管將上清液吸出至于一新的5 ml試管中，放于磁體中靜置10 min;取出上清至15 ml離心管中，并計(jì)數(shù)。然后陽(yáng)性選擇 CD4+CD25+T細(xì)胞，加入 Buffer至15 ml，1100 轉(zhuǎn)離心8 min;去上清，加100 μl Buffer混懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到5ml試管中;每1×107個(gè)細(xì)胞分別加10 μl生物素標(biāo)記的抗鼠 CD25抗體和10 μl Mag-Cellect抗生物素磁珠，依次在2～8℃冰箱中孵育15 min;加Buffer定容至1 ml，輕輕混勻，使溶液處于懸浮狀態(tài)，將試管放于磁體中靜置6 min，當(dāng)試管在磁體中時(shí)，用消毒的移液管吸出上清液并去除;從磁體中取出試管，加1ml Buffer混懸細(xì)胞，重復(fù)一次后從磁體中取出試管，加1 ml Buffer混懸細(xì)胞，此為富含CD4+CD25+T細(xì)胞的細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.3 CD4+CD25+T細(xì)胞純度和活性檢測(cè)

將CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記(CD4-APC、CD25-PE)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度。用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)CD4+CD25+T細(xì)胞進(jìn)行染色，鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

分選前CD4+CD25+Tregs在正常大鼠脾臟和淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中的比例為1.56%，第一步陰性選擇之后CD4+T細(xì)胞的純度為90.75%，第二步陽(yáng)性選擇之后 CD4+CD25+Tregs的純度為86.70%，CD4+CD25+Tregs經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色其活性97.00%。圖1為分選后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

圖1 免疫磁珠分選CD4+CD25+Tregs比例為86.70%

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)最初被描述為CD4+CD25+的T細(xì)胞。新近的研究表明，Tregs由不同種類T細(xì)胞(主要包括CD4+T細(xì)胞、部分CD8+T細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞)所組成。功能性或活化的Tregs表達(dá)一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，F(xiàn)oxP3是Tregs發(fā)生、維持及發(fā)揮功能所必須的。Tregs在抑制免疫系統(tǒng)激活中起關(guān)鍵性作用，因此而維持免疫穩(wěn)態(tài)、預(yù)防自身免疫反應(yīng)及抑制各種因素所致的炎癥反應(yīng)。Tregs功能破壞使免疫系統(tǒng)失調(diào)從而導(dǎo)致炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生。Tregs通過(guò)對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［2，3］。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制性調(diào)節(jié)CD4+或CD8+T細(xì)胞活化與增值，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。該群細(xì)胞的另一個(gè)作用特點(diǎn)是能同時(shí)抑制初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。Sakaguchi等［4］在1995年研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠外周CD4+T細(xì)胞中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞去除后能引起各種自身免疫性疾病，而將此類細(xì)胞輸注到裸鼠體內(nèi)，可以預(yù)防因缺少這類T細(xì)胞亞群所導(dǎo)致的自身免疫性疾病。還可以抑制同種異體移植排斥反應(yīng)，具有巨大的臨床治療應(yīng)用潛能。從而引起研究者對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的濃厚興趣。

Tregs具有免疫無(wú)反應(yīng)性和免疫抑制性兩大特性。Tregs自身的免疫無(wú)反應(yīng)性，表現(xiàn)在其對(duì)于IL-2以及共刺激分子的作用無(wú)反應(yīng)，即使在TCR信號(hào)和IL-2的共同刺激下其增殖活化能力也很低;Tregs的免疫抑制性，則表現(xiàn)為抑制T細(xì)胞的增殖、分化，阻礙抗原提呈細(xì)胞(APC)的抗原提呈作用和直接介導(dǎo)靶細(xì)胞死亡，這些功能主要通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制而發(fā)揮。Tregs的細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制機(jī)制尚未完全研究清楚，然而近年來(lái)的研究表明Tregs表達(dá)的細(xì)胞表面分子TGF-β、CTLA-4、GITR等在Tregs介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制中發(fā)揮重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以直接殺死CD4+或CD8+T細(xì)胞通過(guò)穿孔素或粒酶依賴的機(jī)制。新近研究還發(fā)現(xiàn)，Tregs還可通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子TGF-β、IL-10、IL-35等細(xì)胞因子方式抑制T細(xì)胞的活化和增殖，并且Tregs與T細(xì)胞的直接接觸可提升上述細(xì)胞因子對(duì)T細(xì)胞的抑制作用。Tregs免疫調(diào)節(jié)功能在體內(nèi)的正常發(fā)揮，可抑制自身免疫細(xì)胞的活化，維持自身免疫耐受［5，6］。

磁性細(xì)胞分選(也稱免疫磁珠法)分離提取細(xì)胞的原理是:根據(jù)細(xì)胞表面抗原能和連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結(jié)合，將其置于外加強(qiáng)磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在強(qiáng)磁場(chǎng)中，沒(méi)有此種表面抗原的細(xì)胞由于不能和連接著磁珠的特異性單克隆抗體結(jié)合而無(wú)磁性，在強(qiáng)磁場(chǎng)中不滯留，從而分離出目的細(xì)胞。具有快速、高效、對(duì)靶細(xì)胞的功能活性干擾小的優(yōu)點(diǎn)，并且不需要大型的儀器設(shè)備，還可以在試管中進(jìn)行，容易進(jìn)行無(wú)菌操作，對(duì)細(xì)胞的功能活性影響很小，提取分離后可以進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，還可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)的檢查。因此在對(duì)特定細(xì)胞亞群的功能研究中得到了廣泛的應(yīng)用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞約占正常人或大小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5% ～10%［7］。本實(shí)驗(yàn)我們采用免疫磁珠兩步法(陰性選擇和陽(yáng)性選擇)提取分離大鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，先用陰性選擇提取CD4+T細(xì)胞，向試管內(nèi)細(xì)胞懸液中加入非CD4抗體混合劑，得到富集的CD4+T細(xì)胞，再用抗CD25生物素化抗體和抗生蛋白鏈菌素磁珠陽(yáng)性選擇CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并對(duì)提取的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，最終獲得的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞純度在86.00% 以上，并且活性良好(活細(xì)胞百分率＞97%)。

最近，Liesz等人［8］的研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞是缺血性腦卒中后主要的抗免疫腦保護(hù)調(diào)節(jié)劑。Treg細(xì)胞通過(guò)抵消過(guò)量產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞入侵和/或激活阻止繼發(fā)性梗死增長(zhǎng)。Tregs發(fā)揮抑制免疫和炎癥反應(yīng)作用的分子機(jī)制尚未完全闡明，但可能通過(guò)兩種主要模式即通過(guò)與被抑制的細(xì)胞的細(xì)胞間接觸，或者通過(guò)免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等而起作用。這些作用使T細(xì)胞在炎癥部位自我耐受，免疫穩(wěn)態(tài)，損害控制等領(lǐng)域成為關(guān)鍵因素［9，10］。

因此，通過(guò)提取高純度有巨大潛力的Treg細(xì)胞，拮抗促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)缺血腦組織中淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，防止繼發(fā)性梗死的增長(zhǎng)。這些結(jié)果為急性缺血性腦卒中免疫發(fā)病機(jī)制提供了的新見(jiàn)解，并有可能產(chǎn)生包括使用Treg細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療的新方法。

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