武鵬飛 孫向東 任慶國 李傳福 徐 惠

(1．泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271016;2．泰安市計量測試所，山東 泰安 271000;3．山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟南 250012)

針刺(acupuncture)又稱針灸，是中國的傳統(tǒng)醫(yī) 學(xué)，其療效得到普遍肯定，但是其原理卻一直無法以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)徹底闡明。足三里穴是足陽明胃經(jīng)的合穴，是補益要穴，是最常用的治療穴位之一。多年來的研究結(jié)果表明，針刺穴位與神經(jīng)系統(tǒng)的活動有密切聯(lián)系，特別是與大腦特定皮層功能有關(guān)。功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)是建立在血氧水平依賴(BOLD)的基礎(chǔ)上的MRI技術(shù)，通過檢測特定刺激引起的局部T2加權(quán)像信號的變化揭示特定刺激或任務(wù)與相應(yīng)腦組織的解剖與生理關(guān)系。fMRI的應(yīng)用為針刺機制的探討提供了有利的手段。

非人靈長類動物在結(jié)構(gòu)和生理功能等方面與人類相似，其生理、病理的研究結(jié)果對認識人類生理、病理的發(fā)生機理等醫(yī)學(xué)研究有重要的參考意義。食蟹猴是較為常用的非人靈長類實驗動物。通過針刺食蟹猴左三里穴fMRI的研究，可以探討足三里穴針刺刺激引起的非人靈長類動物腦功能活動，并為病理狀態(tài)下的fMRI研究提供對照。

1 材料與方法

1．1 研究對象

食蟹猴(macaca fascicularis)，屬于靈長目(order Primates)猴科(family Cercopithecidae)，獼猴屬(genus Macaca)，又名長尾獼猴、爪哇猴。采用食蟹猴6只，均為雄性，4 ～5 歲，體質(zhì)量 4．75 ～5．30 kg，平均4．94 kg。六只猴均營養(yǎng)狀態(tài)良好，精神狀態(tài)正常，無神經(jīng)系統(tǒng)病史，近期無藥物使用史。

1．2 實驗設(shè)備

采用GE Signa Excite 3．0T MR掃描儀(Milwaukee，Wisconsin，USA)，梯度場40 mT/m ，梯度切換率150 mT/m/ms。食蟹猴顱腦掃描使用正交膝關(guān)節(jié)線圈，啟用呼吸監(jiān)控。

1．3 食蟹猴麻醉

MR檢查前4 h禁食、水。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛聯(lián)合麻醉。5%氯胺酮誘導(dǎo)麻醉，劑量5 mg/kg，下肢肌肉注射，10%水合氯醛灌腸維持麻醉，劑量1 ml/kg。

1．4 針刺fMRI實驗設(shè)計

對每只食蟹猴針刺左側(cè)足三里穴(zusanli，ST36)的同時進行功能成像掃描。掃描時，采用相同的周圍環(huán)境，食蟹猴頭周耳旁充填軟墊阻隔聲音，僅留微弱燈光供施針醫(yī)師針刺時使用。對于每只實驗猴，針刺刺激采用"OFF－ON－OFF"組塊設(shè)計(圖1)，即"靜息－刺激－靜息"設(shè)計模式。功能成像BOLD序列共采集128phase，其中第1～8phase為靜息狀態(tài)不予實驗氣體氣味刺激;之后以每10phase為一個組塊，分別予以"刺激 －靜息 －刺激 －靜息"，共12個組塊，采集120phase。每phase采集8層圖像，每次fMRI實驗共采集1024幅圖像。針刺任務(wù)過程包括:刺入－捻轉(zhuǎn)－拔出。靜息狀態(tài)時銀針不留置體內(nèi)。

圖1 fMRI"OFF－ON－OFF"組塊設(shè)計

1．5 針刺取穴

選擇左側(cè)足三里穴。針刺過程由同一名有10年針刺經(jīng)驗的針灸醫(yī)師完成。取穴時按照針灸動物實驗的常規(guī)，根據(jù)猴與人體型大小比例，在食蟹猴體表選取相同部位。銀針選用0．35mm×40mm標準銀針。食蟹猴麻醉前備皮，用75%醫(yī)用酒精消毒，在清醒狀態(tài)下進行預(yù)實驗針刺，觀察動物在針刺穴位捻轉(zhuǎn)時出現(xiàn)與針刺非穴位處不同的抽動、不適的表現(xiàn)，認為得氣，穴位準確，確定針刺位置并用龍膽紫標記定位，正式實驗時采用相同的穴位位置。針刺手法采用"平補平瀉"法，捻轉(zhuǎn)均勻，提插幅度適中。

1．6 fMRI掃描參數(shù)

食蟹猴麻醉后仰臥于檢查床上，頭置于正交膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)正中，聽眥線垂直于床面，頭周圍用軟墊充填以減少磁敏感偽影。

MRI掃描序列包括液體衰減反轉(zhuǎn)回復(fù)(fluidattenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR)T1WI序列、fMRI－BOLD掃描。FOV均為14 mm。首先使用軸位FLAIR T1WI序列進行解剖像掃描，掃描線平行于前后連合連線(AC－PC線)，掃描范圍自頂部皮膚至延髓下端，包括全部腦組織。FLAIR T1WI序列參數(shù):TR 2400 ms，TE 9．4 ms，TI 860 ms，ETL 8，Bandwidth:31．25，矩陣320 ×224，NEX 1。掃描層厚2．1 mm，層間隔 0．2 mm。FLAIR T1WI掃描圖像作為fMRI掃描的定位像。fMRI－BOLD掃描采用梯度回波－回波平面成像(gradient echo－echo planar imaging，GRE －EPI)序列，TR 3000 ms，TE 60 ms，F(xiàn)A:90°，矩陣64 ×64，NEX 1，采用壓脂技術(shù)，間隔采集。鑒于該設(shè)備限定每次fMRI掃描總層數(shù)不得超過1024層，為得到更多的圖像數(shù)據(jù)，將整個猴腦分為上下兩部分分兩次掃描，每次掃描8層，兩次掃描通過復(fù)制定位像和定位線的方法使掃描層面相延續(xù)。第二次掃描緊接第一次掃描進行，以免時間延遲導(dǎo)致實驗猴體位變化。fMRI掃描序列的掃描方位、位置、層厚、層間距、層數(shù)、視野等參數(shù)與FLAIR T1WI掃描序列完全一致。每次實驗掃描一半顱腦，8層，128 phase，掃描時間 6min24s，得到 1024 幅圖像，整個猴腦共掃描16層，得到2048幅圖像。

1．7 fMRI數(shù)據(jù)處理

采用運行于Matlab(7．0．1)平臺的專業(yè)醫(yī)學(xué)圖像處理軟件－統(tǒng)計參數(shù)圖2(statistical parametric mapping 2，SPM2)處理實驗數(shù)據(jù)。猴腦fMRI SPM2處理包括以下10個過程:刪除前8 phase靜息態(tài)采集圖像、轉(zhuǎn)換圖像格式、頭動校正、去頭皮、圖像標準化、fMRI設(shè)計、數(shù)據(jù)調(diào)入、評估、計算結(jié)果、解剖圖像覆蓋等過程。

刪除前8 phase靜息態(tài)采集圖像:實驗之初，食蟹猴尚未達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此丟棄前8 phase(64幅)靜息態(tài)采集圖像;將同一種實驗的腦上下兩部分圖像按解剖層面、掃描順序合并排序，使用ADCSee軟件將圖像批處理改名，每種功能狀態(tài)的fMRI掃描共得到1920幅圖像。

轉(zhuǎn)換圖像格式:MRI掃描獲得的圖像數(shù)據(jù)是DICOM格式，需要用MRICro軟件將其轉(zhuǎn)換成SPM可以分析的4D、3D的ANALYZE數(shù)據(jù)格式。

頭動校正:在Matlab程序中載入SPM2軟件，利用SPM2的realign功能進行頭動校正，實現(xiàn)頭部圖像對齊。頭動校正后觀察校正曲線(圖2)，平移(translation)＞1/2個體素或旋轉(zhuǎn)(rotation)＞0．5°的圖像認為體位移動過大，需要丟棄。本實驗全部圖像均為有效圖像。

圖2 SPM2 realign校正曲線

去頭皮:因食蟹猴頭皮組織厚、多，影響圖像分析，手工切去食蟹猴功能圖像的頭皮組織。使用MRICro軟件的ROI功能，沿腦實質(zhì)邊緣，逐層切去頭皮及骨組織。以同樣方式切去食蟹猴模板的頭皮組織，使二者相匹配。

圖像標準化:圖像標準化是指利用統(tǒng)一的腦圖像模板來標準化不同個體的腦，使得不同個體的腦組織功能活動情況統(tǒng)一到同一個腦坐標空間中，以進行統(tǒng)計計算，得到規(guī)律性的結(jié)果。食蟹猴腦模板采用 Black KJ等［1］(Washington University School of Medicine，St．Louis，MO)制作的食蟹猴模板。模板為食蟹猴顱腦軸位T1WI圖像，體素大小為0．5 mm×0．5 mm ×0．5 mm，從頂部皮膚至延髓下方共89層橫斷面。標準化前，將程序默認的部分用于成人圖像處理的參數(shù)根據(jù)食蟹猴的實際進行修改。使用SPM2程序的normalize功能進行圖像標準化處理。

fMRI設(shè)計、數(shù)據(jù)調(diào)入、評估、計算結(jié)果、解剖圖像覆蓋:在SPM2中，為fMRI刺激設(shè)計建立模型，調(diào)入圖像數(shù)據(jù)。

1．8 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPM軟件，采用隨機效應(yīng)模式(random effect mode)進行組分析(group analysis)。采用單樣本t檢驗(one sample t－test)來分析特定任務(wù)刺激下組激活的狀態(tài)。設(shè)定檢驗水準α=0．05，激活區(qū)濾過的標準為＜10個體素。統(tǒng)計結(jié)果覆蓋于食蟹猴模板圖像上。

2 結(jié)果

針刺左側(cè)足三里穴可以觀察到在針刺刺激時，左側(cè)中央前回、右側(cè)中央后回、雙側(cè)島葉、楔前葉、右側(cè)顳葉激活(圖3A)，信號增高，其中，激活最強點位于右側(cè)顳上回(T=6．59)，坐標(14，－15，2);額葉、頂葉、枕葉、扣帶回散在多數(shù)負激活點，在針刺刺激時信號減低(圖3B)，其中，激活最強點位于右側(cè)中央前回(T=9．2)，坐標(18，－5，10)。

圖3 針刺左側(cè)足三里穴猴腦正激活軸位斷層功能定位像

圖4 針刺左側(cè)足三里穴猴腦負激活軸位斷層功能定位像

3 討論

3．1 BOLD －fMRI原理

BOLD－fMRI是依靠血紅蛋白的磁性、根據(jù)MRI對組織磁化高度敏感的特點來研究人腦的功能，特別是大腦各功能區(qū)劃分或定位的無創(chuàng)性檢測技術(shù)。氧合血紅蛋白為逆磁性，脫氧血紅蛋白為順磁性，氧合血紅蛋白的磁敏感特性與一般組織相近，而脫氧血紅蛋白的順磁性會使局部血管內(nèi)及血管周圍出現(xiàn)非均勻性磁場，導(dǎo)致質(zhì)子的失相位、T2*的縮短以及MR信號的損失。當腦組織中局部神經(jīng)元活動時，局部組織內(nèi)血流量及血氧消耗量均增加，但二者增加的比例不同，氧的供應(yīng)量超過代謝的耗氧量，使局部靜脈血氧濃度升高，脫氧血紅蛋白含量降低，體素內(nèi)失相位減少，T2*延長，在T2*加權(quán)像上信號強度增加。通過數(shù)學(xué)運算，將靜息態(tài)的fMRI掃描數(shù)據(jù)與特定刺激狀態(tài)下的fMRI掃描數(shù)據(jù)相比較，MRI信號有明顯差異的腦組織區(qū)域即可推斷為特定刺激所引起的腦功能變化的區(qū)域，即腦功能區(qū)。fMRI最常用于顯示腦功能區(qū)活動時信號增加的激活，即正激活，但是也可以顯示在功能區(qū)活動時信號反而減低的激活，即負激活。目前，負激活的原理尚不清晰，可能與功能區(qū)活動時耗氧量增加超過供氧量增加有關(guān)。

fMRI自20世紀90年代出現(xiàn)以來，在認知科學(xué)研究方面發(fā)揮了巨大的作用。人們利用fMRI做了很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能定位的研究，如:肢體運動、感覺刺激、情感刺激、學(xué)習(xí)記憶任務(wù)和藥物反應(yīng)實驗，都觀測到了特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動，并得出了非常有意義的結(jié)論，為精確了解各種神經(jīng)生理活動提供了有價值的參考。

3．2 針刺 fMRI

針灸的實踐效果是廣為人可的，然而其作用機理一直未完全揭開。經(jīng)過神經(jīng)生理學(xué)的研究，初步認為針灸刺激位于皮膚和肌肉內(nèi)的小的有髓傳入神經(jīng)，將沖動傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌機制，包括β2內(nèi)啡肽等物質(zhì)的釋放，阻斷痛覺傳入大腦;另外，針刺作用于中腦兩個下行系統(tǒng):血清素源性控制系統(tǒng)、腎上腺素源性控制系統(tǒng)來控制痛覺。

多年來的研究結(jié)果表明，針灸穴位與神經(jīng)系統(tǒng)的活動有密切聯(lián)系，特別是與大腦特定皮層功能有關(guān)。應(yīng)用fMRI可以直觀地檢測到針刺引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動［2－3］，為針灸作用機理的揭示奠定了一定的基礎(chǔ)。1998年Cho ZH［4］等發(fā)表了第1篇有關(guān)針刺視覺相關(guān)穴位fMRI的研究論文，證實針刺與視覺相關(guān)的特定穴位可引起特異的腦部視覺中樞的激活。尹嶺［5］等利用fMRI方法探討針刺人足三里穴腦功能成像的實驗方法和針灸治療的機理。Wu MT［6］等利用fMRI驗證了針刺合谷穴和人的大腦邊緣系統(tǒng)的抑制相關(guān)，支持了針刺鎮(zhèn)痛作用的機理。Lee JD［7］通過對比大腦中動脈閉塞所致偏癱患者針灸治療前后的fMRI研究，觀測到針刺合谷、足三里、曲池等穴位對偏癱患者的血供恢復(fù)有益。Kong J［8］、Li G［9］等利用 fMRI研究手針和電針對正常人腦的激活效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)電針和手針刺激有不同的腦組織區(qū)域被激活。多數(shù)研究［10－16］發(fā)現(xiàn)針刺不同的穴位時，第二軀體感覺區(qū)及島葉常能觀測到BOLD信號的增加。部分學(xué)者利用fMRI做動物實驗，探討針灸的作用機理。金香蘭［17］等探討了針刺大鼠的fMRI的動物實驗方法，并且得到針刺大鼠足三里穴引起的部分腦區(qū)MRI信號增加，顯示了fMRI在活體動物實驗中研究針刺作用機理的可行性。

以人和大鼠等小動物為對象通過fMRI研究針刺作用的報道［18－20］已不少，然而，迄今尚無人采用高級非人靈長類動物進行針刺fMRI的研究，并借此與人類的針刺fMRI研究相比較，以進行針刺機理的探討。

足三里穴是足陽明胃經(jīng)的合穴，是補益要穴，是最常用的治療穴位之一，它位于膝關(guān)節(jié)附近，離顱腦較遠，針刺操作不影響顱腦fMRI成像，因此本課題選用足三里穴。

針刺左側(cè)足三里穴可以觀察到在針刺刺激時，右側(cè)中央后回、左側(cè)中央前回、雙側(cè)島葉、楔前葉、右側(cè)顳葉激活;額葉、頂葉、枕葉、扣帶回散在多數(shù)負激活點。

中央后回為軀體感覺區(qū)，雖然實驗猴處于麻醉狀態(tài)，針刺刺激仍可以引起對側(cè)軀體感覺區(qū)的激活。中央前回主要作為軀體運動功能區(qū)，針刺足三里穴引起同側(cè)的中央前回的激活。雙側(cè)島葉、楔前葉有較密集的激活，推測與針灸的復(fù)雜機理有密切的關(guān)系。

針刺左側(cè)足三里穴引起的負激活在額葉、頂葉、扣帶回較多而散在，說明負激活的定位性較差，投射關(guān)系分散，引起的效應(yīng)廣泛。針刺足三里穴可觀察到扣帶回的負激活，扣帶回屬于邊緣系統(tǒng)，邊緣系統(tǒng)在內(nèi)臟調(diào)節(jié)、情緒反應(yīng)、疼痛處理、情感認知等方面具有重要意義，推測針刺引起的扣帶回的負激活在針刺機理及針灸止痛中有重要作用。

針灸作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一個重要組成部分，許多研究表明了針灸對于神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用，因此針灸機理可能是通過自主神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)、體液免疫調(diào)節(jié)等復(fù)雜的過程來發(fā)揮治療作用的，應(yīng)用fMRI所觀測到的只是其復(fù)雜反應(yīng)過程的一部分，并不能反應(yīng)其全部，針刺時不同個體之間的差異可能較大，同一個體的重復(fù)的針刺也可能反映結(jié)果并不完全相同。

3．3 麻醉的影響

本實驗中，為使食蟹猴顱腦位置固定，對食蟹猴進行了麻醉。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛聯(lián)合麻醉的方法。氯胺酮是一具有鎮(zhèn)痛作用的全麻藥?？蛇x擇性抑制丘腦內(nèi)側(cè)核，阻滯脊髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)束的上行傳導(dǎo)，興奮邊緣系統(tǒng)。氯胺酮起效快，蘇醒迅速。水合氯醛是催眠和抗驚厥藥，催眠作用溫和，引起近似生理性睡眠，不縮短REMS睡眠時間，無明顯后遺作用。上消化道或直腸給藥均能迅速吸收，1小時達高峰，維持4～8小時。

麻醉劑影響到神經(jīng)系統(tǒng)的功能和化學(xué)遞質(zhì)的釋放，可能部分影響fMRI的結(jié)果，本實驗研究的是在氯胺酮和水合氯醛聯(lián)合麻醉下的針刺刺激的fMRI成像。

3．4 本研究結(jié)果表明，可以在臨床使用的MRI設(shè)備上對非人靈長類動物進行腦fMRI的研究。在麻醉狀態(tài)下，針刺食蟹猴左側(cè)足三里穴，fMRI可以顯示不同腦組織區(qū)域的正激活和負激活。從正激活方面來看，針刺的作用機理可能與中央前回、島葉及顳上回有較密切關(guān)系。針刺足三里穴引起的負激活定位性較差，投射關(guān)系分散，引起的效應(yīng)廣泛。扣帶回的負激活在針刺機理及針灸止痛中可能有重要作用。

［1］ Black K J，Koller J M，Snyder A Z，et al．Atlas template images for nonhuman Primate neuroimaging:baboon and macaque［J］．Methods in Enzymology，2004，385(11):91－102．

［2］ Hui K K，Liu Jing，Marina O，et al．The integrated response of the human cerebro－cerebellar and limbic systems to acupuncture stimulation at ST 36 as evidenced by fMRI［J］．NeuroImage，2005，27(3):479－496．

［3］ Litscher G，rachbauer D，Ropele S，et al．Acupuncture using laser needles modulates brain function:first evidence from functional transcranial Doppler sonography and functional magnetic resonance imaging［J］．Lasers in Medical Science，2004，19(1):6 －11．

［4］ Cho Z H，Chung S C，Jones J P，et al．New findings of the correlation between acupoints and corresponding brain cortices using functional MRI［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(5):2670 －2670．

［5］ 尹嶺，金香蘭，石現(xiàn)，等．針刺足三里穴PET和FMR I腦功能成像的初步探討［J］．中國康復(fù)理論與實踐，2002，8(9):523－524．

［6］ WU M －t，Hsieh J C，Xiong J，et al．Central nervous pathway for acupuncture stimulation:localization of processing with functional Mr imaging of the brain－ －preliminary experience［J］．Radiology，1999，212(1):133－141．

［7］ Lee J D，Chon J S，Jeong H K，et al．The cerebrovascular response to traditional acupuncture after stroke［J］．Neuroradiology，2003，45(11):780－784．

［8］ KONG Jian，MA Lin，GOLLUB R L，et al．A pilot study of functional magnetic resonance imaging of the brain during manual and electroacupuncture stimulation of acupuncture point(LI－4 Hegu)in normal subjects reveals differential brain activation between methods［J］．Journal of Alternative and Complementary Medicine(New York，N．Y．)，2002，8(4):411 －419．

［9］ LI Geng，CHEUNG R T，MA Qi－ yuan，et al．Visual cortical activations on fMRI upon stimulation of the vision－implicated acupoints［J］．Neuroreport，2003，14(5):669 － 673．

［10］ WU Ming－ting，SHEEN J M，CHUANG K H，et al．Neuronal specificity of acupuncture response:a fMRI study with electroacupuncture［J］．NeuroImage，2002，16(4):1028 －1037．

［11］ Li，LIU Q，L H，et al．R 工 et al．An fMRI study comparing brain activation between word generation and electrical stimulation of language implicated acupoints［J］．Hum Brain Mapp，2003，18(3):233－238．

［12］ LI Q huang － l，Cheung R T．Cortical activations upon stimulation of the sensorimotor－ implicated acupoints［J］．Magnetic Resonance Imaging，2004，22(5):639－644．

［13］ Yoo S S，Teh E K，Blinder R A，et al．Modulation of cerebellar activities by acupuncture stimulation:evidence from fMRI study［J］．NeuroImage，2004，22(2):932 －940．

［14］ Nap adow M N，LIU J．Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI［J］．Human Brain Mapping，2004，24(3):193－205．

［15］ LIU W C，F(xiàn)eldman S C，Cook D B，et al．fMRI study of acupuncture － induced periaqueductal gray activity in humans［J］．Neuroreport，2004，15(12):1937－1940．

［16］ ZHANG Wei－ ting，JIN Zhen，CUI Guo － hong，et al．Relations between brain network activation and analgesic effect induced by low vs．high frequency electrical acupoint stimulation in different subjects:a functional magnetic resonance imaging study［J］．Brain Research，2003，982(2):168－178．

［17］ 金香蘭，尹嶺，劉買利，等．針刺大鼠三里穴腦fMRI成像的初步研究［J］．中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2003，18(12):715 －718．

［18］ 吳志遠，繆飛，項瓊瑤，等．針刺足三里對磁共振腦功能成像影響的研究［J］．中國中醫(yī)藥科技，2007，14(5):305 －307．

［19］ 周誠，王嘉洲，陳敏，等．針刺穴位與大腦皮層之間關(guān)系的腦功能 MRI表現(xiàn)［J］．中華放射學(xué)雜志，2005，39(3):252 －255．

［20］ 肖葉玉，吳仁華，裴仁全，等．針刺足三里穴磁共振功能成像的初步探討［J］．實用放射學(xué)雜志，2004，20(2):106 －108．