朱君榮，魏萌，朱余兵，謝渡江，于鋒，葉飛，陶宜富#(.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院，南京0006；.中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，南京0009)

非瓣膜性房顫已取代風(fēng)濕性心臟病引發(fā)的瓣膜性房顫成為我國(guó)老年人房顫發(fā)病的最主要原因，且其發(fā)生率隨著年齡的增加呈上升趨勢(shì)[1，2]，75歲以上老年人約占非瓣膜性房顫患者的一半[3]。已證實(shí)[4，5]，房顫是腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，口服抗凝藥華法林可有效減少卒中的發(fā)生。華法林能抑制環(huán)氧化還原酶的作用而抑制維生素K在肝臟細(xì)胞內(nèi)合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，從而發(fā)揮其抗凝作用，因療效確切奠定了其在非瓣膜性房顫患者抗血栓治療方案中的基石地位[6，7]，但是該藥抗凝劑量個(gè)體化差異大[8]。已證實(shí)[9，10]，華法林的代謝酶細(xì)胞色素P450(CYP)2 C9和藥效靶點(diǎn)酶VKORC1的編碼基因存在多態(tài)性，這種基因多態(tài)性及年齡、體重、藥物相互作用等臨床特征可解釋約50%的華法林劑量個(gè)體差異，其他華法林劑量個(gè)體差異的相關(guān)因素仍需進(jìn)一步探究[8]，這對(duì)于規(guī)范華法林抗凝治療有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。McDonald等[11]發(fā)現(xiàn)，肝臟CYP酶4 F2編碼基因的多態(tài)性會(huì)對(duì)維生素K的代謝水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而可能導(dǎo)致高加索人群華法林劑量的個(gè)體差異[12-14]，而CYP4 F2的基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者劑量影響的研究尚不多見(jiàn)。本研究旨在結(jié)合CYP4 F2以及CYP2 C9、VKORC1的基因多態(tài)性和其他臨床特征，為中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者臨床合理使用華法林提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用回顧性研究方法，收集2009－2011年南京及周邊地區(qū)非瓣膜性房顫患者260例，均為中國(guó)漢族人種。入選標(biāo)準(zhǔn):確診為非瓣膜性房顫并服用華法林的患者；穩(wěn)定服用華法林3個(gè)月以上(目標(biāo)國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)比值(INR)為1.5～3.0[15，16])。排除:明確的出血性疾病，如活動(dòng)性潰瘍、支氣管擴(kuò)張等；肝功能不全患者(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或者天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)＞3倍上限或者膽紅素＞2倍上限)；腎功能不全患者(血清肌酐≥200 μmol·L－1)；需長(zhǎng)期服用抗血小板藥物或非甾體抗炎藥者。

1.2 臨床資料的收集

從所有納入研究的患者病例資料中摘錄性別、年齡、身高、體重、聯(lián)合用藥等基線信息以及華法林劑量和基因測(cè)定結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行常規(guī)隨訪。每位患者至少被記錄3次以上在目標(biāo)范圍內(nèi)的華法林用藥劑量。華法林平均穩(wěn)定劑量為患者所測(cè)INR值在1.5～3.0之間所記錄的華法林總服用量的日平均劑量。體重指數(shù)(BMI)＝體重(kg)/身高(m)2；體表面積(BSA)＝0.0061×100×身高(m)+0.0128×體重(kg)－0.1529。

1.3 基因分型

1.3.1 基因組DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增患者簽署知情者同意書(shū)后，收集EDTA抗凝的外周靜脈全血2 mL。采用AxyPrep-96 Blood基因組提取試劑盒(Axygen Biosciences，美國(guó))提取DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。CYP2 C9*3、VKORC11173和CYP4 F2基因的引物由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成(見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系體積為20μL，基因組DNA 50ng，上、下游引物各0.4μL，dNTP 2 mmol·L－1，1×PCR緩沖液2 μL，3 mmol·L－1MgCl20.6 μL，Taq聚合酶(1 U·L－1)0.3 μL，1×Q-solution 4 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，94℃30 s，62℃90 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

表1 SNPs位點(diǎn)的上、下游引物Tab 1 Forward and reverse primers of SNPs

1.3.2 基因多態(tài)性檢測(cè)用連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)檢測(cè)CYP2 C9*3、VKORC11173和CYP4 F2的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。LDR反應(yīng)體系體積為10 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，各位點(diǎn)探針1 μL，1×LDR緩沖液1 μL，Taq聚合酶(2 U·L－1)0.05 μL。LDR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min，94℃15 s，50℃45 s，共35個(gè)循環(huán)。在ABI PRISM 3730 DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems，美國(guó))上完成測(cè)序。用Gene Mapper軟件(Applied Biosystems，美國(guó))完成數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示；研究對(duì)象Hardy-Weinberg遺傳平衡的符合程度采用χ2檢驗(yàn)；不同基因型組間華法林口服劑量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)用于分析華法林劑量需求與年齡、體重、身高、聯(lián)合用藥以及基因多態(tài)性的關(guān)系。采用多元線性回歸法(Stepwise篩選法)得到各變量對(duì)華法林劑量需求的貢獻(xiàn)率以及總影響度。

2 結(jié)果

2.1 患者基線信息

患者房顫卒中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(CHADS2)得分范圍為2～6分，平均CHADS2得分為(4.2±1.4)分，其他基線信息詳見(jiàn)表2。

表2 患者的基線信息(n，%)Tab 2 Baseline characterastics of the patients(n，%)

2.2 基因分型結(jié)果

2.2.1 Genemapper數(shù)據(jù)分析利用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SNPs位點(diǎn)Genemapper分型圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 基因檢測(cè)結(jié)果CYP4 F2 rs2108622、CYP2 C9 rs1057910和VKORC1 rs9934438基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。所有基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。基因型頻數(shù)(%)＝(攜帶某基因型的人數(shù)/總?cè)藬?shù))×100%；等位基因頻數(shù)(%)＝[(攜帶某等位基因雜合子的人數(shù)+攜帶某等位基因純合子人數(shù)×2)/(總?cè)藬?shù)×2)]×100%。

2.3 CYP2 C9*3、VKORC1和CYP4F2基因型與華法林劑量間的關(guān)系

CYP2 C9*1/*3攜帶者所需的華法林日穩(wěn)定劑量為(1.93±1.14)mg，顯著低于CYP2 C9*1/*1攜帶者[(2.72±0.89)mg，P＝0.001]。VKORC11173 TT型攜帶者所需的華法林日劑量低于CT型攜帶者[(3.12±1.20)mg·d－1vs.(2.36±0.87)mg·d－1，P＝0.047]。CYP4 F2TT基因攜帶者所需的華法林日劑量為(3.04±0.98)mg，顯著高于CT型患者[(2.66±1.02)mg，P＝0.037]和CC型患者[(2.60±0.84)mg，P＝0.034]。

多元線性回歸的結(jié)果顯示:年齡、體重、血栓史、合并應(yīng)用β受體阻滯藥或胺碘酮、CYP2 C9*3、VKORC11173以及CYP4 F2各項(xiàng)共解釋了非瓣膜性房顫患者51.7%的華法林劑量差異。多元線性回歸分析扼要結(jié)果見(jiàn)表4。其中，CYP4 F2、血栓史以及合并應(yīng)用β受體阻滯藥分別解釋了4.8%、2.1%和2.6%的華法林劑量差異?；貧w方程為Dose＝3.47－0.022(年齡)+0.017(體重)+0.189(血栓史)－0.283(β受體阻滯藥)－0.471(胺碘酮)－0.586(CYP2 C9*1/*3)－0.296(VKORC1 CT)+0.219(CYP4 F2TT)。其中，年齡以“歲”表示；體重以“kg”表示；有過(guò)血栓史、合并使用胺碘酮或β受體阻滯藥，出現(xiàn)以上情況則編碼為1，否則編碼為0；對(duì)于CYP2 C9*1/*3、VKORC11173 CT、CYP4 F2 TT基因型，出現(xiàn)以上基因型則編碼為1，否則編碼為0。

表3 SNPs位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率Tab 3 Allelic frequency and genotype of SNPs site

表4 多元線性回歸分析扼要結(jié)果Tab 4Brief results of stepwise regression analysis

3 討論

華法林是香豆素類口服抗凝藥，通過(guò)抑制肝臟維生素K環(huán)氧化還原酶，導(dǎo)致無(wú)活性的氧化型維生素K無(wú)法還原為有活性的還原型維生素K，阻止維生素K的循環(huán)應(yīng)用，干擾維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活化，從而達(dá)到抗凝的目的[17]。研究[11]表明，CYP4 F2的編碼基因——CYP4 F2 rs2108622的基因多態(tài)性會(huì)引起還原型維生素K氧化酶活性的個(gè)體間差異，進(jìn)而影響華法林的劑量需求。McDonald等[11]在高加索人群中的研究顯示，CYP4 F2野生型(CYP4 F2 CC)攜帶者還原型維生素K的氧化酶活性最高，CT攜帶者次之，而TT攜帶者還原型維生素K的氧化酶活性只有CC攜帶者的1/4；CYP4 F2 rs2108622 T攜帶者體內(nèi)有活性的還原型維生素K水平也高于CYP4 F2CC患者，需要的華法林劑量也相應(yīng)增加。研究[12，13]已證實(shí)，CYP4 F2 rs2108622基因多態(tài)性對(duì)高加索人種華法林的劑量需求的影響為1.5%～2%，對(duì)中國(guó)漢族心臟瓣膜置換術(shù)后患者的華法林劑量需求影響為3.2%～4%[18，19]。但與心臟瓣膜置換術(shù)后患者只需單用華法林抗凝不同，非瓣膜性房顫患者常合并高血壓、冠心病等多種疾病，聯(lián)合用藥也相應(yīng)增加，這些疾病和藥物都可能會(huì)對(duì)華法林的抗凝效果產(chǎn)生一定影響。

中、西方人種CYP2 C9*3和VKORC11173突變頻率的巨大差異可以部分解釋中、西方患者華法林劑量之間的差異[9，10]。但是本研究結(jié)果顯示，中國(guó)漢族非瓣膜房顫患者CYP4 F2 rs2108622 T的突變頻率為27.3%，與中國(guó)健康人群中T的突變頻率(25%)接近，與高加索人群中的突變頻率(28%)差別也不大[20]，由此看出CYP4 F2 rs2108622的突變可能不是導(dǎo)致中、西方患者華法林劑量差異的主要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，CYP4 F2 rs2108622 T攜帶者所需的華法林劑量比C攜帶者高0.4mg·d－1，該位點(diǎn)的基因多態(tài)性可以解釋4.8%的華法林劑量差異；而在高加索人群中的研究顯示，T攜帶者所需的華法林劑量比C攜帶者高≥1 mg·d－1[14]，但該位點(diǎn)的基因多態(tài)性只解釋了1.5%～2%的華法林劑量差異[11，13]，這種現(xiàn)象提示CYP4 F2 rs2108622的基因多態(tài)性可能對(duì)中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者的華法林劑量的影響大于高加索人群。這可能是因?yàn)橹袊?guó)漢族患者對(duì)華法林的抗凝作用較為敏感，達(dá)到相同的抗凝效果所需要的華法林劑量也低于高加索人種，所以在中國(guó)漢族人群中很小的華法林劑量改變卻能在較大程度上解釋華法林的劑量差異，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

另外，通過(guò)多元線性回歸發(fā)現(xiàn)，有血栓栓塞史的患者所需的華法林劑量要略高于無(wú)栓塞史的患者(2.76 mg·d－1vs 2.43 mg·d－1，P＝0.047)，這與Gage等[21]的研究結(jié)果相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，β受體阻滯藥(如普萘洛爾)也在一定程度上解釋了華法林的劑量差異，Holbrook等[22]也報(bào)道了這一現(xiàn)象。但是，β受體阻滯藥影響華法林抗凝效果的機(jī)制仍需進(jìn)一步探明。另外，胺碘酮也是影響華法林劑量的重要因素，其影響機(jī)制可能是胺碘酮及其代謝產(chǎn)物不僅可以改變?nèi)A法林肝內(nèi)代謝的立體選擇性，通過(guò)抑制CYP2 C9和CYP1 A2活性，影響S-華法林的代謝失活使其血藥濃度升高；同時(shí)，還可以降低S-和R-華法林的清除率，從代謝和清除兩個(gè)方面增強(qiáng)華法林的抗凝作用[23，24]。

綜上所述，本研究證實(shí)CYP4 F2 rs2108622基因多態(tài)性可以顯著影響中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者的華法林劑量。同時(shí)，本研究結(jié)合年齡、體重、合并疾病、聯(lián)合用藥以及CYP2 C9、VKORC1和CYP4 F2的基因多態(tài)性建立了中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者的華法林抗凝治療的劑量預(yù)測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)華法林穩(wěn)定劑量與年齡、合并用胺碘酮或者β受體阻滯藥、CYP2 C9*3及VKORC11173位點(diǎn)的基因突變呈負(fù)相關(guān)，而與體重、合并血栓史及CYP4 F2位點(diǎn)的基因突變呈正相關(guān)，希望新模型能為進(jìn)一步優(yōu)化非瓣膜性房顫患者的華法林個(gè)體給藥方案提供一定的理論依據(jù)。

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