張 盼， 宋國(guó)華， 喬 奇， 秦艷紅，張德勝， 田雨婷， 鄭文明， 張振臣＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，鄭州 450002；3.河南省許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心，許昌 461000）

煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）的快速檢測(cè)技術(shù)

張 盼1，2， 宋國(guó)華3， 喬 奇2， 秦艷紅2，張德勝2， 田雨婷2， 鄭文明1， 張振臣2＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，鄭州 450002；3.河南省許昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心，許昌 461000）

建立了利用NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的方法，比較了3種檢測(cè)方法的靈敏性。結(jié)果表明，NCM－ELISA最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV；RT－PCR能穩(wěn)定地從3頭以上帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV；半巢式RT－PCR能穩(wěn)定地從單頭煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV。檢測(cè)靈敏性研究表明，用體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為核酸模板，RT－PCR可檢測(cè)的最低濃度為5.69×104拷貝／μL，半巢式RT－PCR為5.69×101拷貝／μL，說(shuō)明半巢式RT－PCR檢測(cè)方法的靈敏性比RT－PCR高1 000倍。

甘薯褪綠矮化病毒； 煙粉虱； 硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定； 半巢式RT－PCR

甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochloroticstunt virus，SPCSV）屬于長(zhǎng)線(xiàn)形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）成員。該病毒的基因組為雙組分單鏈正義RNA，基因組大小為17.6kb左右［1］。根據(jù)血清學(xué)關(guān)系和核苷酸序列，SPCSV可劃分為東非（EA）和西非（WA）兩個(gè)株系［2］。20世紀(jì)70年代首先在非洲發(fā)現(xiàn)了SPCSV，目前主要分布在非洲和南美的一些國(guó)家［3］。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特別重要的是，SPCSV可與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotatofeatherymottle virus，SPFMV）協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet potato virus disease，SPVD）。SPVD 是甘薯上最嚴(yán)重的病毒病害之一，通常可使甘薯減產(chǎn)50%～98%，甚至絕收［3－4］。

2010年Qiao等［5］首先報(bào)道了SPCSV在我國(guó)的發(fā)生。張振臣等［6］在我國(guó)廣東、江蘇、四川、安徽等主要甘薯產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)了SPVD的存在，說(shuō)明SPVD在我國(guó)已有較廣泛的分布。SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由煙粉虱（Bemisiatabaci）以半持久方式傳播［7］，感染SPCSV的甘薯通常會(huì)迅速的形成SPVD，SPVD的流行跟煙粉虱的數(shù)量密切相關(guān)［8］。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的方法，對(duì)于該病的預(yù)警和防治具有重要意義。近年來(lái)，硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（NCM－ELISA）［9］，反 轉(zhuǎn)錄 － 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（RT－PCR）［10］，巢式 RT－PCR［11］等方法已經(jīng)被用于傳毒昆蟲(chóng)中病毒的檢測(cè)，但目前尚未見(jiàn)針對(duì)煙粉虱中SPCSV檢測(cè)方法的研究報(bào)道，為此，我們建立了利用 NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式 RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的方法，比較了3種檢測(cè)方法的可靠性和靈敏性，期望獲得一種快速、高效的檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)SPCSV的方法。

1 材料與方法

1.1 供試毒源和煙粉虱

將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲(chóng)溫室內(nèi)用于飼養(yǎng)煙粉虱，將經(jīng)過(guò)飼養(yǎng)3d以上的煙粉虱成蟲(chóng)視為帶毒煙粉虱。無(wú)毒煙粉虱采自棉花田，每年7－9月份從河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽(yáng)試驗(yàn)基地的大田棉花上采集煙粉虱成蟲(chóng)，用健康的四季小白菜飼養(yǎng)兩周后作為陰性對(duì)照。收集帶毒煙粉虱成蟲(chóng)和無(wú)毒煙粉虱成蟲(chóng)用液氮速凍后，置于－70℃保存?zhèn)溆?。將?jīng)過(guò)NCM－ELISA和RT－PCR檢測(cè)SPCSV為陰性的甘薯莖尖培養(yǎng)試管苗作為甘薯陰性對(duì)照。

1.2 試劑及試劑盒

SPCSV的硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（NCM－ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自國(guó)際馬鈴薯中心（CIP）；UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司；RNase抑制劑、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA 聚合酶、pMD19－T載體、T7RNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司。其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已登錄的SPCSVhsp70基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)3條引物CSV70P1：5′－GACGG（G／T）GGTAC（G／T）ATGAA（A／G）GTCC－3′，CSV70P2：5′－GGCTCACAAAC（A／T／C）GA（C／T）TTCATAAACAT－3′，CSV70P3：5′－TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG－3′。 其 中，CSV70P1和CSV70P2用作半巢式RT－PCR的第1輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp；CSV70P1和CSV70P3用作半巢式RT－PCR的第2輪擴(kuò)增引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為170bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 NCM－ELISA檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

用解剖針挑取煙粉虱成蟲(chóng)放入1.5mL離心管中，加入100μL抽提緩沖液，用研磨棒充分研磨，5 000r／min離心3min。取上清液5μL點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，室溫晾干，然后按照NCM－ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先將膜浸入封閉緩沖液中室溫封閉1h，洗滌后加入SPCSV特異性抗體溶液，室溫孵育過(guò)夜；然后棄去抗體溶液，洗滌后加入酶標(biāo)抗體溶液，室溫孵育1h；最后，棄去酶標(biāo)抗體溶液，洗滌后加入底物溶液，顯色60min，蒸餾水洗膜終止反應(yīng)。陽(yáng)性樣品在膜上形成紫色沉淀，陰性樣品則無(wú)顏色反應(yīng)。利用NCM－ELISA方法分別對(duì)1、2、4、8、16、32、64、128頭和256頭煙粉虱中的SPCSV進(jìn)行檢測(cè)，分別以無(wú)毒煙粉虱和SPCSV CP基因的原核表達(dá)蛋白作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。同樣的處理，重復(fù)檢測(cè)3次，以測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.5 RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

用解剖針挑取單頭煙粉虱成蟲(chóng)放入加有30μL預(yù)冷的RNA提取液的1.5mL離心管中，用DEPC處理過(guò)的研磨棒充分研磨，再用170μL的抽提液沖洗研磨棒，然后按照UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi)總RNA。利用RT－PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄體系為：4μL RNA 模板，2μL 5×RT buffer，0.5μL CSV70P2（10μmol／L），1μL dNTPs（10mmol／L），0.25μL RNase抑制劑（40U／μL）和0.5μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶 （5U／μL），用 DEPC－H2O 補(bǔ)足 10μL，42℃反轉(zhuǎn)錄40min，99℃5min，5℃5min。PCR反應(yīng)體系為：2.5μL cDNA，2.5μL 10×PCR buffer，1μL dNTPs（2.5mmol／L），0.5μL CSV70P1（10μmol／L）和CSV70P2（10μmol／L），0.2μLTaq酶（5U／μL），用ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、UVP凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察和照相。

1.6 半巢式RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

取4μL核酸模板按1.5中的條件進(jìn)行首輪RT－PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，取1μL產(chǎn)物作為第2輪PCR擴(kuò)增的模板，第2輪PCR擴(kuò)增體系為：2.5μL 10×PCR buffer，1μL dNTPs（2.5mmol／L），0.5μL CSV70P1（10μmol／L）和CSV70P3（10μmol／L），0.2μLTaq酶（5U／μL），用ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，完成32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物的電泳、染色及成像同1.5。

1.7 RT－PCR和半巢式 RT－PCR產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定

將部分RT－PCR和半巢式RT－PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽(yáng)性克隆。核苷酸序列測(cè)定由TaKaRa公司完成。利用DNAMAN和BLAST軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比較分析。

1.8 RT－PCR和半巢式 RT－PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性比較

按照T7RNA Polymerase說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄。在上游引物CSV70P1的5′端引入T7啟動(dòng)子序列，以SPCSVhsp70基因的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的雙鏈DNA片段（454bp）在T7 RNA聚合酶的作用下經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA（cRNA），純化后用核酸測(cè)定儀測(cè)得cRNA濃度為148.1ng／μL，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度換算為5.69×1011拷貝／μL（cRNA 含量＝6.02×1023×148.1×10－9／（454×345）＝5.69×1011拷貝／μL）。將該cRNA用DEPC－H2O按10倍梯度稀釋成5.69×1010～5.69×101拷貝／μL，分別取濃度為5.69×107～5.69×101拷貝／μL的7個(gè)濃度梯度的RNA作為檢測(cè)模板，分別按照1.5和1.6方法進(jìn)行RT－PCR和半巢式RT－PCR靈敏性檢測(cè)，比較兩者靈敏性的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCM－ELISA檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

以SPCSV特異性抗體作為一抗，應(yīng)用NCMELISA方法分別檢測(cè)1、2、4、8、16、32、64、128頭和256頭煙粉虱中的SPCSV。結(jié)果表明，NCMELISA方法最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV，相同數(shù)量的無(wú)毒煙粉虱和健康甘薯檢測(cè)結(jié)果為陰性（圖1）。同樣的處理重復(fù)檢測(cè)3次，靈敏性和特異性結(jié)果均相同。

圖1 NCM－ELISA檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

2.2 RT－PCR檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

以提取的煙粉虱總RNA為模板，利用引物CSV70P1／CSV70P2進(jìn)行 RT－PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，從10、5、3、2和單頭帶毒煙粉虱中均能擴(kuò)增出一條大小為431bp的特異性條帶，而從無(wú)毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗均中未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶（圖2）。為了檢驗(yàn)RT－PCR檢測(cè)帶毒煙粉虱的穩(wěn)定性，分別對(duì)單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱各進(jìn)行了10次RT－PCR重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單頭煙粉虱中SPCSV的檢出率是40%，2頭檢出率為60%，3頭的檢出率為100%。說(shuō)明利用RT－PCR方法能穩(wěn)定檢測(cè)出3頭煙粉虱中的SPCSV。

圖2 RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

2.3 半巢式RT－PCR檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)的SPCSV

采用半巢式RT－PCR分別對(duì)單頭、2頭、3頭帶毒煙粉虱中SPCSV的帶毒情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，半巢式RT－PCR從單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱體內(nèi)均能擴(kuò)增出170bp的目的條帶，而不能從無(wú)毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗中擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖3）。對(duì)單頭帶毒煙粉虱進(jìn)行了10次半巢式RT－PCR重復(fù)檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%。說(shuō)明利用半巢式RT－PCR方法能穩(wěn)定檢測(cè)出單頭煙粉虱中的SPCSV。

圖3 半巢式RT－PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV

2.4 RT－PCR和半巢式RT－PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定

RT－PCR和半巢式RT－PCR擴(kuò)增出的片段序列測(cè)定結(jié)果表明，所克隆片段的核苷酸序列與SPCSV WA株系的相似性為97.6%～100%，說(shuō)明兩種方法所擴(kuò)增出的片段均為SPCSV的特異性片段。

2.5 RT－PCR和半巢式 RT－PCR 檢測(cè)SPCSV的靈敏性比較

以制備的SPCSV的cRNA作為模板，進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，RT－PCR可檢測(cè)的cRNA最低濃度為5.69×104拷貝／μL（圖4）。以第1輪RT－PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行半巢式RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果半巢式RT－PCR最低能從濃度為5.69×101拷貝／μL的cRNA中檢測(cè)出SPCSV（圖5），表明建立的半巢式RT－PCR的檢測(cè)靈敏度比RT－PCR高1 000倍。

圖4 RT－PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性

圖5 半巢式RT－PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性

3 討論

本試驗(yàn)采用了 NCM－ELISA、RT－PCR和半巢式RT－PCR 3種方法對(duì)煙粉虱中的SPCSV進(jìn)行檢測(cè)，3種方法均能從帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV，但靈敏性有差異。NCM－ELISA的檢測(cè)靈敏性最低，RT－PCR 其 次，半 巢 式 RT－PCR 最 高。NCMELISA方法比較簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，在很小的NC膜上可以進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，結(jié)果可以長(zhǎng)期保存，但檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，最低能從16頭帶毒煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV。RT－PCR能從單頭煙粉虱中檢測(cè)出SPCSV，但由于每頭煙粉虱中的帶毒量可能不同，以及RNA提取與反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)造成部分RNA的損失，檢測(cè)單頭煙粉虱時(shí)不太穩(wěn)定，有假陰性情況的出現(xiàn)。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)只有從3頭以上的帶毒煙粉虱中才能穩(wěn)定地檢測(cè)出SPCSV。半巢式RT－PCR的檢測(cè)靈敏度最高，比RT－PCR的靈敏度高1 000倍，能從單頭帶毒煙粉虱體內(nèi)穩(wěn)定地檢測(cè)出SPCSV，可防止因病毒含量低而漏檢。此外，半巢式RT－PCR通過(guò)第2輪PCR擴(kuò)增，可以進(jìn)一步驗(yàn)證第1輪RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，其擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性也高于RT－PCR。

SPCSV的長(zhǎng)距離傳播主要通過(guò)種薯和種苗，而短距離主要通過(guò)煙粉虱進(jìn)行傳播［7－8，12］。煙粉虱生存能力強(qiáng)、繁殖速度快，據(jù)報(bào)道，煙粉虱經(jīng)過(guò)48h的飼毒就能進(jìn)行有效傳染，而且煙粉虱的數(shù)量越大，病毒傳播的有效性越強(qiáng)［8，12］，因此，建立高效快速的檢測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)煙粉虱帶毒情況的監(jiān)測(cè)，對(duì)于該病毒的預(yù)警和防治具有重要意義。我國(guó)自2010年首次發(fā)現(xiàn)SPCSV以來(lái)［5］，目前在全國(guó)多個(gè)甘薯種植區(qū)陸續(xù)檢測(cè)到該病毒病的存在［6］，由于對(duì)SPCSV尚無(wú)特別有效的防治方法，做好煙粉虱帶毒率的檢測(cè)，加強(qiáng)對(duì)煙粉虱的防治，可有效減少SPCSV的蔓延擴(kuò)散，減少病害引起的損失。

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Rapid detection technologies of theSweetpotatochlorotic stuntvirusinBemisiatabaci

Zhang Pan1，2， Song Guohua3， Qiao Qi2， Qin Yanhong2， Zhang Desheng2，Tian Yuting2， Zheng Wenming1， Zhang Zhenchen2
（1.CollegeofLifeSciences，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.InstituteofPlantProtection，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.AgriculturalProductsQualitySafetyTestingandInspectionCentreinXuchang，Xuchang461000，China）

The methods of NCM－ELISA，RT－PCR and semi－nested RT－PCR were used to detect theSweetpotato chloroticstuntvirus（SPCSV）in the whiteflyBemisiatabaci，and the sensitivities of these methods were compared.The results showed that SPCSV could be detected from at least 16 whiteflies carrying the virus by NCMELISA，occasionally from single whitefly and steadily from more than three whiteflies by RT－PCR；SPCSV could be steadily detected from single insect by semi－nested RT－PCR.WithinvitroRNA transcript as template，the sensitivity were up to5.69×104copies／μL and5.69×101copies／μL by RT－PCR and semi－nested RT－PCR，respectively，indicating that the detection sensitivity of the semi－nested RT－PCR was 1 000 times higher than that of the RT－PCR.

Sweetpotatochloroticstuntvirus（SPCSV）；Bemisiatabaci； NCM－ELISA； semi－nested RT－PCR

S 432.41

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.016

2011－12－26

2012－04－25

國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS－11－B－07）

＊ 通信作者Tel：0371－65711547；E－mail：zhangzhenchen＠126.com