屠 晶，胡青海，于圣青，丁 鏟，韓先干，朱寅玉，王小蘭，苗 雙，盧鳳英

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）感染是當(dāng)前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。該病已呈世界范圍分布，由于該病分布的廣泛性以及引起雛鴨的高死亡率，發(fā)育遲緩和淘汰率增加，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

鴨疫里默氏桿菌是黃桿菌科鴨疫里默氏桿菌屬的代表種，已確認(rèn)的血清型有21個(gè)[1]，但目前對(duì)鴨疫里默氏桿菌的毒力相關(guān)基因還知之甚少，已經(jīng)確定的毒力基因只有ompA[2]。另外，還推測(cè)一些因子可能與致病性相關(guān)，如pCFC1質(zhì)粒中含有兩個(gè)毒力相關(guān)基因vapD1和vapD2[3-4]，以及CAMP溶血素[5]等。在一些病原菌中血凝素是重要的毒力因子，如在沙門氏菌、霍亂弧菌、大腸桿菌和百日咳博德特氏菌等[6-9]，可作為一種粘附素在細(xì)菌感染過(guò)程中參與細(xì)菌粘附到宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定了鴨疫里默氏桿菌CH3株的全基因組，解析后發(fā)現(xiàn)基因組中存在血凝素基因，這與Zhou等的報(bào)道一致[10]。本研究將對(duì)鴨疫里默氏桿菌血凝素基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并對(duì)其蛋白在細(xì)菌中的定位進(jìn)行了分析，為下一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和血清 鴨疫里默氏桿菌CH3株（血清1型）、WJ4株（血清 1型）、NJ3株（血清 2型）、Th4株（血清 2型）、HXb2（血清 10型）、NN8株（血清 15型）和JY6株（未定型）由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；E.coliDH5α及BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鴨抗鴨疫里默氏桿菌CH3株、Th4株（血清 2型）和 HXb2（血清 10型）陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 載體、酶及主要試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；Expand High Fedility PCR system購(gòu)自Roche公司；原核表達(dá)載體pET-28a（+）購(gòu)自Novagen公司；pGEM-T easy載體、T4 DNA ligase購(gòu)自Promega公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鴨IgG購(gòu)自香港Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 血凝素基因的克隆和鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)鴨疫里默氏桿菌血清1型CH3全基因組中血凝素基因的序列，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。上游引物P1：5'-TAGGATCC ATGAAAAAGTTTTTGATAGCTTCGGC-3'（BamHⅠ）；下游引物P2：5'-GTCTCGAGTTATCTGCGTGGAGC TTTCTTTTG-3'（XhoⅠ）。 引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增提取不同血清型鴨疫里默氏桿菌的基因組，作為PCR模板擴(kuò)增血凝素基因。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、52℃ 40 s、72℃ 70 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 Min。PCR產(chǎn)物連接pGEM-T，轉(zhuǎn)化JM 109感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pT-hemag-X（菌株名）。由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，用DNAS-tar7.01軟件進(jìn)行序列分析。

1.4 血凝素基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pT-hemag-CH3，回收目的片段與經(jīng)同樣酶切處理的pET-28a載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選、鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pET-hemag。

1.5 血凝素基因表達(dá)及鼠抗鴨疫里默氏桿菌血凝素陽(yáng)性血清的制備 將pET-hemag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后菌體并超聲破碎，離心后分別收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE分析重組血凝素蛋白的表達(dá)與可溶性。

表達(dá)的血凝素重組蛋白包涵體經(jīng)復(fù)性、純化后與ISA50佐劑乳化，免疫BALB/c小鼠制備鼠抗鴨疫里默氏桿菌血凝素陽(yáng)性血清。

1.6 Western blot分析 鴨疫里默氏桿菌CH3株（血清1型）、Th4株（血清2型）和HXb2（血清 10型）的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印[9]至PVDF膜，5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，以1∶500稀釋的鼠抗血凝素蛋白陽(yáng)性血清作為一抗，1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行western blot試驗(yàn)，分析鼠抗CH3株血凝素蛋白血清與1、2、10型鴨疫里默氏桿菌的反應(yīng)性。

同時(shí)，重組血凝素蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、半干轉(zhuǎn)印后，分別與1∶300稀釋的鴨抗鴨疫里默氏桿菌CH3株（血清1型）、Th4株（血清2型）和HXb2（血清10型）陽(yáng)性血清作為一抗，及1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鴨IgG作為二抗進(jìn)行western blot，以檢測(cè)鴨血清中有無(wú)抗血凝素的抗體。

1.7 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 1%雞、鴨或鵝的紅細(xì)胞懸液按常規(guī)方法制備。以新城疫病毒La Sota株作為陽(yáng)性對(duì)照，血凝試驗(yàn)按照OIE介紹的新城疫病毒血凝試驗(yàn)的方法進(jìn)行。

1.8 鴨疫里默氏桿菌中血凝素蛋白的定位分析 用懸浮熒光法分析鴨疫里默氏桿菌血凝素蛋白。培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌CH3株，稀釋細(xì)菌到107cfu/mL，100μL菌液分別與100μL 1:50，1:250，1:500稀釋的鼠抗血凝素陽(yáng)性血清室溫作用2 h，PBS洗滌5次，再與羊抗鼠 IgG-FITC（1∶100）室溫作用 2 h，PBS洗滌3次后用少量PBS重懸細(xì)菌，熒光顯微鏡下 觀 察 結(jié) 果 。設(shè) 立 鼠鴨疫里默氏桿菌多克隆抗血清作為陽(yáng)性對(duì)照，na ve小鼠血清作為陰性對(duì)照。用在線軟件PSORTb v.3.0預(yù)測(cè)血凝素蛋白在細(xì)菌中的定位。

2 結(jié)果

2.1 血凝素基因的克隆，鑒定與序列測(cè)定 利用PCR方法從所檢測(cè)的不同血清型鴨疫里默氏桿菌菌株中均擴(kuò)增到了血凝素基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)一條1 kb左右的條帶，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果表明從CH3株中擴(kuò)增出的血凝素基因大小為 1 059 bp（圖 1），編碼 352個(gè)氨基酸（JN937575～JN937580）。用CDD分析表明其蛋白中存在3個(gè)保守的功能域，即Glucosam inidase superfamily domain（aa 34～aa 161）、 Lysin domain（aa 249～aa 291）和 MltD domain（aa 220～aa 329）。同源性分析表明，5種不同血清型血凝素蛋白的氨基酸同源性為94.1%～100%，其中已在GenBank中登錄的全基因組序列的DSM 15868株（CP002346）與其他鴨疫里默氏桿菌菌株的血凝素氨基酸同源性為94.3%～98.3%，均為血清1型的CH3和WJ4間血凝素同源性為94.9%，而WJ4與JY6株（未定型）血凝素的氨基酸同源性為100%。以上結(jié)果還提示鴨疫里默氏桿菌血凝素同源性的高低與菌株有關(guān)，而與血清型無(wú)關(guān)。鴨疫里默氏桿菌血凝素與黃桿菌3519-10株血凝素（NC_013062）的氨基酸同源性為68.0%～68.9%，與大腸桿菌NRG 857C（CP001855）推測(cè)的血凝素/粘附素的氨基酸同源性為19.0%～19.5%（圖2）。CDD分析表明，鴨疫里默氏桿菌血凝素蛋白有Glucosaminidase和LysM兩個(gè)超家族（圖2）。

圖2 鴨疫里默氏桿菌血凝素蛋白保守的結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 The conserved domains on the hemagglutinin protein of R.anatipestifer

2.2 Hemagglutinin基因的原核表達(dá)和western blot分析BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切和PCR鑒定，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pET-hemag轉(zhuǎn)化BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明在40 ku左右有一條明顯的表達(dá)帶。表達(dá)的蛋白均存在于裂解細(xì)菌的上清和包涵體中，以包涵體的形式存在為主（圖3）。Western blot結(jié)果顯示，本研究中制備的鼠抗血凝素陽(yáng)性血清能夠與鴨疫里默氏桿菌 CH3株（血清 1型）、Th4株（血清 2型）和 HXb2（血清10型）菌體中的血凝素蛋白反應(yīng)，但與CH3株血凝素蛋白的反應(yīng)比另外2個(gè)血清型血凝素蛋白的反應(yīng)強(qiáng)（圖4）。另外，表達(dá)的血凝素蛋白能與鼠抗血凝素陽(yáng)性血清反應(yīng)，但是與鴨抗鴨疫里默氏桿菌CH3株（血清1型）陽(yáng)性血清、鴨抗Th4株（血清2型）陽(yáng)性血清、鴨抗HXb2株（血清10型）陽(yáng)性血清均無(wú)反應(yīng)（圖 5）。

圖3 血凝素蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.3 Analysis of the expression of hemagglutinin in E.coli by SDS-PAGE

圖4 Western blot檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌中血凝素蛋白Fig.4 Detection of R.anatipestifer hemagglutinin protein prepared mous antiserum by western blot

2.3 血凝素蛋白在鴨疫里默氏桿菌中的定位分析紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)表明，鴨疫里默氏桿菌CH3、Th4、HXb2、NN8和JY6等菌株均不凝集雞、鴨和鵝的紅細(xì)胞。Western blot的結(jié)果顯示本研究中制備的鼠抗鴨疫里默氏桿菌血凝素抗體與菌體中的血凝素蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)（圖4），并且該抗體與以可溶性（存在于表達(dá)菌體的裂解上清中）及以包涵體形式的重組血凝素蛋白均能反應(yīng)（圖5），初步表明該血凝素抗體可用于后續(xù)試驗(yàn)中血凝素的檢測(cè)。鴨疫里默氏桿菌免疫鴨體內(nèi)沒(méi)有血凝素抗體，提示這種血凝素可能不是一種膜蛋白。采用懸浮熒光法來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明菌體經(jīng)間接免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察鴨疫里默氏桿菌的表面無(wú)特異性熒光。而陽(yáng)性對(duì)照鼠抗鴨疫里默氏桿菌多克隆抗血清與鴨疫里默氏桿菌做IFA，呈現(xiàn)明顯熒光。在線軟件PSORTb v.3.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明，鴨疫里默氏桿菌的血凝素定位于胞漿。

圖5 Western blot檢測(cè)免疫鴨血清中血凝素的抗體Fig.5 Detection of ant-hemagglutinin antibody w ith R.anatipestifer immunized duck sera by western blot

3 討論

血凝素在許多細(xì)菌病原體中都是重要的毒力因子。血凝素通常表達(dá)在細(xì)菌的表面作為一種粘附素，與細(xì)菌表面的鞭毛樣結(jié)構(gòu)如鞭毛粘附素或非鞭毛表面成份如非鞭毛粘附素一起，使細(xì)菌粘附到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面[8]。一些病原菌（包括尿路致病性大腸桿菌、百日咳博德特氏菌、霍亂弧菌和傷寒沙門氏菌）粘附到宿主細(xì)胞的能力與其凝集紅細(xì)胞的能力相關(guān)，而且研究表明這些細(xì)菌的血凝素在細(xì)菌感染過(guò)程中作為凝集素[9]。黃桿菌科的一些菌株具有血凝活性，黃桿菌3519-10株等細(xì)菌基因組中存在血凝素基因[11-12]，但對(duì)于其功能目前還研究的比較少。鴨疫里默氏桿菌的血凝素是否也是一種毒力因子尚不清楚。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)分析表明，鴨疫里默氏桿菌的血凝素可能定位于胞漿內(nèi)，這與其他病原菌的血凝素定位于膜表面有所不同。由于鴨疫里默氏桿菌Riean_1717基因氨基酸與黃桿菌血凝素（FIC_02084）氨基酸的同源性較高（68%左右），分析認(rèn)為其為血凝素基因。但黃桿菌的有些菌株有鞭毛，也具有血凝活性；而鴨疫里默氏桿菌無(wú)鞭毛，并且鴨疫里默氏桿菌血凝素與大腸桿菌血凝素的同源性也只有19%左右。因此，不能以其他細(xì)菌血凝素定位于細(xì)菌表面來(lái)判斷鴨疫里默氏桿菌血凝素的定位。根據(jù)GenBank中登錄的2株鴨疫里默氏桿菌的全基因組序列，對(duì)該蛋白的解析也有差異。在DSM 15868株（CP002346.1）相關(guān)蛋白（Riean_1717）的解析為FIC_02084血凝素（KEGG/SPTR）、胞壁質(zhì)酶（COGs）、甘露糖基糖蛋白內(nèi) -β-n-乙酰葡糖胺酶（PFAM）；而 RA-GD株（CP002562.1）相關(guān)蛋白（RIA_0466）的解析為鞭毛特異的胞壁質(zhì)酶。因此，該蛋白更可能是胞漿中的一種酶。在線軟件COGnitor預(yù)測(cè)結(jié)果也表明，該蛋白與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和分泌有關(guān)。細(xì)菌蛋白的定位與功能密切相關(guān)，鴨疫里默氏桿菌血凝素的生物學(xué)功能還有待通過(guò)基因缺失等手段進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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