焦同路，王靖飛，趙雙成，王世達，常曉飛，田 石，柳金雄，李雁冰，姜永萍*，陳化蘭*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江哈爾濱 150001）

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的主要流行于雞群中的烈性傳染病。根據(jù)AIV表面糖蛋白HA和NA抗原性的差異可以將其分為16個HA亞型和9個NA亞型，其中H5N1亞型屬于高致病AIV。1996年在廣東省分離出中國境內(nèi)第一株高致病性的H5N1 AIV（A/goose/Guangdong/1/96），隨后在中國的南方地區(qū)又分離出多株H5N1 AIV[1]，其中1997年在香港分離的一株H5N1 AIV能夠感染人并致死[2]。據(jù)統(tǒng)計2004~2008年期間中國共暴發(fā)104次H5N1 AIV引起的禽流感[3]，對禽類養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的威脅。目前中國的禽流感防制主要是采取捕殺并結(jié)合疫苗免疫的策略。

AI防制的疫苗主要有滅活疫苗和重組病毒活載體疫苗，但滅活疫苗的應(yīng)用不利于疫情的監(jiān)測，而重組病毒活載體疫苗則可避免這一不足，因此重組病毒活載體疫苗成為研究的熱點。禽痘病毒（FPV）具有廣泛的宿主嗜性，持續(xù)感染的時間比較長，能承載大片段外源DNA等優(yōu)點，已成功用于多種病原基因的表達[4-6]。一些報道表明插入流感病毒HA基因的重組FPV對家禽具有良好的免疫保護效果[7-9]，但隨著流感病毒的變異，原有的疫苗不能對一些變異株提供有效的免疫保護。本實驗利用含有g(shù)fp和gpt的雙篩選標記的轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt[10]，將流行于我國南方水禽的H5N1 AIV代表株A/Duck/Anhui/1/06（H5N1）（簡稱AH/06）的HA基因同源重組到FPV中。構(gòu)建了表達HA蛋白的重組禽痘病毒（rFPV-gpt-gfp-AHHA），為進一步的免疫效力研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞 鵪鶉源FPV（CVCCAV1003）、含有AH/06 HA基因的重組質(zhì)粒pMD-HA和轉(zhuǎn)移載體pSY-681-gfp-gpt均由本研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室保存；CEF由本研究所實驗動物中心提供的9日齡SPF雞胚制備。

1.2 主要試劑 FuGENE HD Transfection Reagent購自羅氏公司；Mycophenolicacid、Xanthine、Hypoxantine購自Sigma公司；rTaqDNA聚合酶、NotⅠ、AflⅡ、Phusion DNA Polymerase、T4DNA連接酶購自NEB公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗雞IgG（IRDyeR800）購自Rockland公司；感受態(tài)細胞JM 109購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 pSY681-gfp-gpt-AHHA的構(gòu)建根據(jù)AIVAH/06 HA基因的ORF區(qū)設(shè)計一對引物，并且在上游引物的5'端加入酶切位點AflⅡ和kozak序列（5'-CGCTTAAGGCCGCCACCATGGAGAAAATA GTGCTT-3'），下游引物的5'端加入酶切位點NotⅠ（5'-CTAGCGGCCGCTTAAATGCAAATTCTGC-3'），以pMD-HA為模板用Phusion DNA Polymerase擴增HA基因的ORF片段。將其采用NotⅠ、AflⅡ分步酶切后回收，用T4連接酶連接到經(jīng)同樣酶切的pSY681-gfp-gpt中得到pSY681-gfp-gpt-AHHA。

1.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA的構(gòu)建與篩選 參照文獻方法用FPV感染CEF，感作2 h后棄去病毒液。按照FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑的說明書將pSY681-gfpgpt-AHHA轉(zhuǎn)染于FPV預(yù)感染的CEF中，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變（CPE）時收獲細胞，反復(fù)凍融3次后用于篩選。首先利用標記基因gfp表達的綠色熒光蛋白在熒光顯微鏡下挑取熒光蝕斑進行幾輪篩選，待大部分蝕斑呈現(xiàn)綠色熒光時，同時利用雙重篩選標記gfp和gpt在含低熔點瓊脂糖的培養(yǎng)液中加入霉酚酸（25μg/mL）、次黃嘌呤（15μg/mL）、黃嘌呤（250μg/mL）以抑制殘留野生病毒的增殖，經(jīng)過幾輪篩選后得到完全純化的含有雙標記基因和HA基因的rFPV-gfp-gpt-AHHA。

1.5 rFPV-gfp-gpt-AHHA的鑒定及HA基因表達產(chǎn)物的western blot鑒定 收集重組病毒感染后病變的 CEF，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取其總DNA，以其為模板用特異性引物進行PCR擴增。同時收集病變的細胞反復(fù)凍融后超聲裂解，進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上。以AIV AH/06的特異性多克隆血清為一抗（1∶200），以兔抗雞 IgG（IRDyeR800）為二抗，鑒定 rFPV-gfp-gpt-AHHA表達的HA蛋白的抗原活性。

1.6 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長曲線比較將純化的rFPV-gfp-gpt-AH-HA和親本FPV分別以0.1 MOI量感染CEF，在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。分別于接毒24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后收獲病毒反復(fù)凍融3次后測定PFU，繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt-AHHA的鑒定 以pMD-HA為模板進行HA基因的擴增，得到大小約為1 700 bp的ORF片段，將其克隆到到約為8 000 bp的轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt中。PCR鑒定pSY681-gfp-gpt-AHHA，結(jié)果顯示目的條帶的大小與理論值相符（圖1）；NotⅠ、AflⅡ雙酶切的結(jié)果也顯示得到的兩條目的條帶與HA基因的ORF片段及轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt的理論值相符（圖1）。

2.2 rFPV-gfp-gpt-AHHA的純化與擴增 將pSY681-gfp-gpt-AHHA轉(zhuǎn)染于預(yù)感染FPV的CEF中進行同源重組，利用雙篩選標記gfp和gpt純化rFPV-gfpgpt-AHHA。首先利用gfp篩選標記對轉(zhuǎn)染后收獲的病毒進行幾輪篩選，至大部分病毒蝕斑在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光時，再用gfp和gpt雙重篩選標記進行幾輪篩選，最后得到純化的rFPV-gfp-gpt-AHHA。用rFPV-gfp-gpt-AHHA感染CEF，待細胞病變后熒光顯微鏡下觀察，所有的病毒蝕斑均呈現(xiàn)綠色熒光（圖 2），反復(fù)凍融病變的 CEF收獲增殖的 rFPV-gfp-gpt-AHHA。

2.3 rFPV-gfp-gpt-AHHA的PCR鑒定及HA基因表達產(chǎn)物的western blot鑒定 以提取的重組禽痘病毒的總DNA為模板，用特異性引物進行PCR鑒定，結(jié)果得到大小約為1 700 bp的條帶，并與理論值相符（圖3），同時測序的結(jié)果也顯示rFPV-gfp-gpt-AHHA中插入了HA基因的ORF片段并且沒有發(fā)生氨基酸突變。用特異性多克隆血清進行的western blot鑒定也表明rFPV-gfp-gpt-AHHA能夠穩(wěn)定的表達HA 蛋白（圖 3）。

2.4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長曲線 病毒在不同生長點的蝕斑結(jié)果顯示rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV在正常條件下培養(yǎng)96 h后病毒滴度達到最大值，兩者之間生長情況基本一致（圖4）。生長曲線表明外源基因的插入并沒有影響親本FPV的復(fù)制，rFPV-gfp-gpt-AHHA能夠穩(wěn)定的復(fù)制。

3 討論

針對AIV，具有免疫保護性的蛋白主要是HA、NA和NP，但由于抗NA的抗體不能夠中和病毒，而NP蛋白在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性還不足以對致死攻擊提供有效的保護[11]，所以HA蛋白是目前流感亞單位疫苗和重組活載體疫苗的主要免疫性抗原。

圖4 rFPV-gfp-gpt-AHHA和FPV的生長曲線Fig.4 One-step growth curve for rFPV-gfp-gpt-AHHA and FPV

喬傳玲等將AIV A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）的HA基因同源重組到親本痘病毒S-FPV-017中，構(gòu)建的重組禽痘病毒活載體疫苗自2005年起開始在中國部分地區(qū)投入使用并取得良好的效果[9]，但為了應(yīng)對AIV重組變化可能帶來的抗原漂移，本實驗選取了流行于我國南方水禽中的H5N1高致病性禽流感抗原群的代表株AH/06的HA基因進行同源重組，制備新一代的痘病毒活載體流感疫苗。重組禽痘病毒的篩選和純化工作是本實驗的關(guān)鍵點，實驗顯示由于原代細胞轉(zhuǎn)染效率比較低，因此在重組禽痘病毒最初幾代的篩選過程中不能利用gpt篩選標記進行藥物壓力篩選，以防重組禽痘病毒的丟失。本實驗中我們首先利用gfp標記進行多輪篩選后，再同時利用gfp和gpt雙重篩選標記進一步的純化重組禽痘病毒。同時為提高HA蛋白的表達量本實驗在HA基因的起始密碼子之前加入了Kozak序列。

本實驗構(gòu)建了能夠穩(wěn)定復(fù)制的rFPV-gfp-gpt-AHHA，并對其表達的HA蛋白進行了western blot驗證，表明了rFPV-gfp-gpt-AHHA表達的HA蛋白具有良好的抗原活性，為進一步的免疫效力研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Chen Hua-lan,Deng Guo-hua,Tian Guo-bin,et al.The evolution of H5N1 influenza viruses in Ducks in Southern China[J].PNASUSA,2004,101（28）:10452-10457.

[2]Shortridge K,Zhou Nan-nan,Guan Yi.Characterization of avian H5N1influenza viruses from poultry in Hong Kong[J].Virology,1998,252:331-342.

[3]Chen Hua-lan.H5N1 avian influenza in China[J].Sci China Ser C-Life Sci,2009,52（5）:419-427.

[4]Heine H G,Boyle D B.Infectious bursal disease virus structural protein VP2 expressed by fow lpox virus recombinant confers protection against diseases in chickens[J].Arch Virol,1993,131:277-292.

[5]Nazerian K,Yanagida N.A recombinant fow lpox virus expressing the envelope antigen of subgroup a avian leukosis/sarcoma virus[J].Avian Dis,1995,39（3）:514-520.

[6]Cardona C J,Reed W M,W itter R L,et al.Protection of turkeys from hemorrhagic enteritis with a recombinant fow l poxvirus expressing the native hexon of hemorrhagic enteritis virus[J].Avian Dis,1999,43（2）:234-244.

[7]Webster R,Kawaoka Y,Taylor J,et al.Efficacy of nucleoprotein and haemagglutinin antigens expressed in fow lpox virus as vaccine for influenza in chickens[J].Vaccine,1991,9:303-308.

[8]Ma Xiao-ming,Jin Ning-yi,Wang Zhen-guo,et al.Construction and immunogenicity of recombinant fow lpox vaccines coexpressing HA of AIV H5N1 and chicken IL18[J].Vaccines,2006,24:4304-4311.

[9]Qiao Chuan-ling,Yu Kang-zhen,Jiang Yong-ping,et al.Protection of chickens against highly lethal H5N1 andH7N1 avian influenza viruses w ith a recombinant fow lpox virus co-expressing H5 haemagglutin and N1 neuram inidase genes[J].Avian Pathol,2003,32:25-31.

[10]王艷麗，李俊輝，姜永萍，等.以GPT和GFP為雙重篩選標記的禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（7）：501-504.

[11]喬傳玲，于康震，姜永萍，等.表達禽流感病毒核蛋白基因重組禽痘病毒的構(gòu)建及其免疫保護性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（3）：704-708.