于德民，韓宗璽，邵昱浩，劉曉麗，孔憲剛，劉勝旺

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究病毒感染組織細(xì)胞后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，能夠更有效地發(fā)現(xiàn)直接或間接參與病原復(fù)制的細(xì)胞蛋白[1]。雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜（MS）鑒定的差異蛋白質(zhì)組學(xué)可以有效地分析病毒感染細(xì)胞的分子背景[2]。目前，2-DE結(jié)合MS方法在研究病毒與宿主組織細(xì)胞的相互作用關(guān)系中已得到廣泛應(yīng)用[3-6]。為分析新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染雞腎臟后，病毒誘導(dǎo)組織蛋白的表達(dá)變化情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)雙向電泳條件進(jìn)行一系列控制與優(yōu)化，建立了雞腎臟組織2-DE，并對(duì)2-DE圖譜上的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了初步分析，并利用熒光定量PCR對(duì)其中的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，為深入研究NDV的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 La Sota疫苗株由本實(shí)驗(yàn)室保存；30只SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 固相化24 cm干膠條（pH4～pH 7、線性）、IPG 緩沖液（pH4～pH7）、2-D Quant kit、2-D Clean-up kit、Protease inhibitorM ix、Nuclease Mix、考馬斯亮藍(lán) R350（PhastGel Blue R）均購(gòu)自GE Health-care公司；High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits、SYBR Green PCR Master Mix均購(gòu)自ABI公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司；Ettan IPGphorⅢ固相pH梯度等電聚焦儀、SE600 Ruby標(biāo)準(zhǔn)垂直電泳系統(tǒng)、Image ScannerⅢ圖像掃描儀、ImageMaster 2D Platinum6.0圖像分析軟件均為GE Health-care公司產(chǎn)品。

1.3 組織樣品的制備 將30只SPF雞分為兩組，每只雞接種100μL（106EID50）病毒，分別在接種疫苗后的3 d、7 d、12 d和21 d采取雞腎臟組織，液氮研磨，取100 mg樣品加入1 ML裂解液（7 M尿素、2 M硫脲、4%CHAPS、40 mM DTT 2%IPG buffer pH3～pH10 or pH4～pH7、1%Nuclease Mix、1%蛋白酶抑制劑），室溫放置3 h，每15 min震蕩一次。15 000 r/min 4℃離心1 h。取上清，采用2-D Clean-up試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

1.4 蛋白濃度的測(cè)定 采用蛋白定量試劑盒計(jì)算待測(cè)樣品濃度，每個(gè)測(cè)試樣品做3次重復(fù)，以3個(gè)重復(fù)值中最接近的兩個(gè)值的平均值作為最終濃度。

1.5 雙向凝膠電泳

1.5.1 第一向電泳根據(jù)計(jì)算所得的樣品濃度及其所需上樣量，計(jì)算樣品所需體積，并且用水化液（7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、40 mM DTT 2%IPG buffer pH3～pH 10 or pH4～pH7）補(bǔ)足體積到450μL。13 000 r/min 20℃離心10 Min，取上清。將樣品均勻加入膠條槽中，在每根膠條上覆蓋1.5m L礦物油，按優(yōu)化的等電聚焦參數(shù)進(jìn)行膠條水化和等電聚焦過(guò)程，整個(gè)過(guò)程的溫度設(shè)置為20℃，每根膠條限流50μA，結(jié)束后取出IPG膠條，除去膠條上的礦物油及多余樣品，將膠面朝上轉(zhuǎn)移到平衡管中，進(jìn)行膠條平衡和第二向凝膠電泳。

1.5.2 膠條的平衡將膠條用平衡緩沖液Ⅰ（6mmol/L尿素、0.375 mmol/L Tris-HCl pH8.8、20%丙三醇、2%SDS、2%DTT；20m L/24 cm 膠條）平衡 15min；轉(zhuǎn)入平衡緩沖液Ⅱ（6 mmol/L尿素、0.375 mmol/L Tris-HCl pH8.8、20%丙三醇、2%SDS、2.5%碘乙酰胺；20m L/24 cm膠條）中平衡15min。

1.5.3 第二向電泳同時(shí)灌制6塊12%SDS-PAGE凝膠，將平衡的膠條置于凝膠上方，用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠溶液封閉膠條，待其凝膠凝固后進(jìn)行第二向電泳。在16℃恒溫循環(huán)水浴系統(tǒng)中進(jìn)行電泳。電泳條件：1 W/膠條功率條件下電泳60 Min后，再以5W/膠條功率電泳約7 h，直至溴酚藍(lán)指示劑離分離膠下緣約1 mm時(shí)停止電泳。

1.6 凝膠染色 電泳結(jié)束后取出凝膠于固定液中固定2 h，10%乙酸敏化15 min，染色液染色8 h或過(guò)夜，最后更換10%乙酸脫色液脫色至背景清楚。

1.7 凝膠掃描和圖像分析 脫色的凝膠經(jīng)ImageScanner掃描儀掃描，獲得的凝膠圖譜采用ImageMaster 2D Platinum 6.0進(jìn)行圖像對(duì)比度調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、蛋白點(diǎn)匹配，以及表達(dá)差異蛋白點(diǎn)的檢測(cè)。表達(dá)點(diǎn)強(qiáng)度值在感染組和未感染組比值達(dá)到1.5倍以上為上調(diào)顯著（ratio of infected/mock≥1.5，p≤0.05），表達(dá)點(diǎn)強(qiáng)度值在未感染組和感染組比值達(dá)到1.5倍以上為下調(diào)顯著（ratio of mock/infected≥1.5，p≤0.05）。只有3個(gè)樣本中均重復(fù)出現(xiàn)的差異點(diǎn)才可以被鑒定為差異表達(dá)蛋白。

1.8 膠內(nèi)酶切及質(zhì)譜鑒定 將表達(dá)的差異蛋白點(diǎn)由凝膠中切出置于EP管中，由上海中科新生命有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。將肽質(zhì)量指紋圖（PMF）結(jié)合MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MASCOT檢索NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)，種屬選擇為雞，蛋白鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：離子得分置信區(qū)間（C.I.%）≥95%。

1.9 組織RNA的提取及熒光定量PCR分析 腎臟組織總RNA的提取按照RNeasy Mini試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物，以18S RNA（FP：CGGACAGGATTGACAGATTGAG； RP： GCCAGA GTCTCGTTCGTTATC）為內(nèi)參基因，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄按照High-Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR參照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 雞腎臟組織雙向凝膠電泳方法的建立 采用細(xì)胞裂解液處理法對(duì)腎臟組織進(jìn)行總蛋白提取，在進(jìn)行正式雙向凝膠電泳分析之前，分別對(duì)膠條pH范圍、水化條件、等電聚焦、膠條平衡、凝膠染色方法等變量進(jìn)行控制與優(yōu)化。不同pH膠條顯示，采用pH3～pH10的IPG膠條進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白點(diǎn)主要集中在pH4～pH 8范圍內(nèi)（圖1-A），選用pH4～pH 7的線性IPG膠條，蛋白點(diǎn)則均勻地分布在整塊膠上并且形狀比較規(guī)整（圖1-B）。經(jīng)上述條件優(yōu)化表明：對(duì)于雞腎臟組織而言，采用24 cm pH4～pH 7線性IPG膠條，以1.3mg的上樣量在12%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行二向分離的效果較好。

2.2 NDV感染CEF電泳圖譜分析 采用Image-Master6.0分析圖像可以檢測(cè)到1 400個(gè)左右的蛋白點(diǎn)，多數(shù)蛋白點(diǎn)集中在凝膠的中間區(qū)域。3次2-DE批內(nèi)蛋白點(diǎn)在重復(fù)樣品的匹配率達(dá)到90%以上，表明電泳圖譜的分辨率高、重復(fù)性好，為分析NDV感染前后CEF總蛋白表達(dá)差異奠定了基礎(chǔ)。共檢測(cè)到29個(gè)蛋白點(diǎn)存在差異（圖2），其中有15個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，有14個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。

圖2 部分差異表達(dá)蛋白Fig.2 The 2-DE profiles of some differentially expressed proteins

2.3 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果 將4個(gè)差異表達(dá)蛋白（K5、I17、A11和A22）經(jīng)膠內(nèi)酶切后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，Mascot檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。參考UniProt Know ledgebase蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息進(jìn)行鑒定（表1）。

2.4 差異表達(dá)蛋白基因的熒光定量PCR分析 將K5、I17、A11、A22 4個(gè)差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行驗(yàn)證，以看家基因18S RNA為內(nèi)參，進(jìn)行相對(duì)定量。熒光定量PCR在mRNA水平的分析結(jié)果同雙向電泳圖像分析結(jié)果一致（圖3）。

3 討論

不同來(lái)源、不同組織樣品的2-DE，一般都需要優(yōu)化其最佳試驗(yàn)條件[7]。本研究分別優(yōu)化了組織的清洗辦法、雞腎臟組織蛋白的裂解和純化辦法、一向的最佳上樣量、一向電泳的最佳電壓程序。由于腎臟組織包含比較多的血液，血液中蛋白不但干擾腎臟組織蛋白的分析，而且血液中的鹽分干擾一向聚焦，進(jìn)而影響到凝膠的重復(fù)性，因此在研磨和裂解蛋白前對(duì)腎臟組織的清洗是非常必要的。本研究通過(guò)4℃PBS將腎臟組織中的血液洗凈，又通過(guò)短暫的低溫條件下離心去除PBS，然后進(jìn)行蛋白純化，有效地降低一向聚焦電流（結(jié)果未列出），取得了較好的結(jié)果，TCA/丙酮沉淀法純化蛋白的電泳圖譜中雖然橫豎條紋較少，但導(dǎo)致部分蛋白點(diǎn)的丟失（結(jié)果未列出）。通過(guò)使用2-D Clean up試劑盒可以獲得比較好的純化結(jié)果。

表1 4個(gè)差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果和對(duì)應(yīng)的引物Table 1 Summary of proteins differentially expressed in kindey tissues infected by NDV and the corresponding primers

選擇合適的膠條型號(hào)是雙向電泳條件優(yōu)化的重要內(nèi)容。為了首先得到該組織凝膠圖的全貌，首先制作24 cm pH3～pH 10的凝膠，分析顯示膠中蛋白點(diǎn)在其中pH4～pH 8范圍內(nèi)比較集中，形狀規(guī)則，因此利用24 cm pH范圍pH4～pH 7膠條制作凝膠，得到預(yù)期結(jié)果，24 cm pH4～pH7 IPG的膠條上樣量通常為1.0 mg～1.4 mg，上樣量低可以很好地分離蛋白點(diǎn)，而上樣量高更利于低豐度蛋白的分析，因而通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索我們得出對(duì)于24 cm pH4～pH7 IPG膠條而言，使用1 300 ug的上樣量，就本實(shí)驗(yàn)而言，可以取得良好的結(jié)果。

保證雙向凝膠電泳結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照和疫苗接種的6只雞進(jìn)行獨(dú)立配對(duì)，分為3組，并對(duì)每一組進(jìn)行獨(dú)立的平行試驗(yàn)和分析，最終取在3組中共同存在的差異蛋白確認(rèn)為最終的差異蛋白。減少了生物個(gè)體之間的差異，同時(shí)對(duì)每一組的兩個(gè)樣品相同條件下同時(shí)進(jìn)行一向和二向的電泳以及后期凝膠分析，盡可能減少6張膠之間的技術(shù)差異，保證雙向凝膠電泳結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

蛋白的翻譯后修飾使得mRNA量不能與蛋白水平一致[8-10]，但應(yīng)用相對(duì)熒光定量技術(shù)驗(yàn)證雙向電泳結(jié)果被廣泛采用。本研究通過(guò)熒光定量PCR對(duì)7dpi的4種差異蛋白進(jìn)行mRNA水平的檢測(cè)，結(jié)果與雙向結(jié)果保持一致。證明了本研究建立的以雙向電泳為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的可靠性和重復(fù)性。

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白有待于進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，為NDV和宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制、揭示NDV的可能致病機(jī)制等提供有意義的信息。

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