王隆柏，王晨燕，吳學(xué)敏，方勤美，車勇良，陳如敬，魏 宏，莊向生，周倫江*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是 由 PRRS病 毒（PRRSV）引起的一種豬烈性傳染病[1]。該病至1987年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近年來(lái)，PRRSV致病力有所增強(qiáng)，尤其是2006年以來(lái)由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的高致病性PRRS[3-4]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊。

自1994年首次提出蛋白質(zhì)組（Proteom ic）概念以來(lái)，該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[5]。在病毒蛋白質(zhì)組研究方面，Chelius等用2DE LC-MS/MS分析了腺病毒蛋白質(zhì)組，鑒定了11種病毒蛋白[6]，Chertova等應(yīng)用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分析了產(chǎn)生于單核巨嗜細(xì)胞（MDM）的HIV-1病毒粒子的蛋白，鑒定了253個(gè)宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白[7]。然而，應(yīng)用2-DE技術(shù)研究HP-PRRSV蛋白質(zhì)組研究尚未見報(bào)道。為研究HP-PRRSV蛋白質(zhì)組，本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響HP-PRRSV蛋白質(zhì)組的2-DE條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了重復(fù)性好、分辨率高的HP-PRRSV 2-DE，為HP-PRRSV的病毒蛋白質(zhì)組學(xué)及免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細(xì)胞 HP-PRRSV FJ06A株由本科室分離和保存；66代MARC-145細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（Urea）、3-[3-（膽酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、碘乙酰胺（Iodoacetam ide）、TEMED、IPG膠條（pH3-pH10）、IPG緩沖液、2-D clean-up Kit試劑盒均購(gòu)自GEHealthcare Bio-Sciences公司；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自Fermentas公司。

1.3 儀 器 Ettan IPGphorⅢ等電聚焦系統(tǒng)、Ettan IPGphor Manifold膠條槽、Ettan DALTsix大型垂直電泳系統(tǒng)、ImagescannerⅢ掃描儀、ImageMaster 2D Platinum 6.0分析軟件及MultiTemp恒溫控制儀均為GE Healthcare Bio-Sciences公司產(chǎn)品。

1.4 HP-PRRSV增殖及濃縮 將HP-PRRSV接種于Marc-145單層細(xì)胞，接毒量為0.5 ML（病毒毒價(jià)為5×106.5TCID50），按常規(guī)方法培養(yǎng)病毒，將細(xì)胞病毒液反復(fù)凍融3次后，經(jīng)超聲裂解15 Min，20 000 r/m in離心60m in，棄沉淀，取上清45000 r/min離心240m in，收獲沉淀為濃縮病毒。

1.5 樣品制備 濃縮的HP-PRRSV用0.1 mol/L Tril-HCl洗滌3次，吸干Tril-Hcl，置37℃恒溫箱蒸發(fā)水分20 Min，加入適當(dāng)裂解液，冰上渦旋溶解后置液氮2 Min取出解凍，反復(fù)凍融4次，將樣品超聲波處理15 Min，其中超聲波裂解8 s，間歇8 s，處理后置冰浴中震蕩1 h，于4℃10 000 r/m in離心1 h，取上清。按2-D clean-up Kit試劑盒方法純化蛋白，用Brandford法檢測(cè)蛋白濃度，分裝至Eppendof管中保存于-70℃冰箱。

1.6 雙向電泳的建立

1.6.1 第一向等電聚焦（IEF）采用7 cm IPG膠條pH3～10，樣品用水化液[8 M尿素，2%（w/v）CHAPS，0.5%（v/v）IPG緩沖液，0.002%的1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)備溶液]溶解，上樣量為130μg，上樣體積為125μL。置IPGphor等電儀器，在20℃環(huán)境溫度下進(jìn)行等電聚焦。其等電聚焦電壓和時(shí)間依次為30 V 14 h、100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、8 000 V 1 h、8 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h。

1.6.2 平衡及第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.6.3 染 色按參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行，染色凝膠用Image Scanner掃描儀透射掃描，分辨率300 dpi保存圖像。

1.6.4 凝膠圖像分析凝膠圖像進(jìn)行掃描后，用軟件Image Master 2-DE Platinum 6.0進(jìn)行圖像的處理，設(shè)置參數(shù)Smooth值為2，M inArea值為5，Saliency值為250。

1.7 雙向電泳的優(yōu)化

1.7.1 第一向等電聚焦樣品上樣量為200μg，硝酸銀染色。試驗(yàn)設(shè)計(jì)2種一向等點(diǎn)聚焦程序，分別為程序Ⅰ和程序Ⅱ，程序Ⅰ的聚焦電壓和時(shí)間依次為 30 V 14 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、5 000 V 1 h、5 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h，程序Ⅱ的聚焦電壓和時(shí)間依次為30 V 14 h、100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、3 000 V 1 h、8 000 V 1 h、8 000 V 20 000 Vh、500 v 10 h，其他條件一致。

1.7.2 染色試劑采用一向等電聚焦上樣量為160μg進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，比較經(jīng)典考馬斯亮蘭和硝酸銀染色效果。經(jīng)典考馬斯亮蘭的染色步驟依次用20%三氯乙酸固定1 h，0.1%考馬斯亮藍(lán)、40%乙醇和10%乙酸染色2 h，40%乙醇和10%乙酸30m in脫色2次，1%乙酸強(qiáng)化過(guò)夜，去離子水清洗30m in；硝酸銀染色方法見1.6.3，其他條件一致。

1.7.3 樣品上樣量采用相同樣品，上樣量分別為80μg、120μg、160μg和 200μg 4組進(jìn)行電泳，采用硝酸銀染色，其他條件一致。

1.7.4 顯色時(shí)間樣品上樣量為200μg，硝酸銀染色，加入顯色液后分別進(jìn)行了顯色4 Min和6 Min，分析顯色效果，其他條件一致。

1.8 HP-PRRSV培養(yǎng)物與MC-145細(xì)胞蛋白雙向電泳 分別將HP-PRRSV培養(yǎng)物和MC-145細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融3次后，經(jīng)超聲裂解15m in，20 000 r/min離心60min，棄沉淀，取上清45000 r/min離心240min，收獲沉淀，沉淀物采用與HP-PRRSV樣品相同的制備方法，通過(guò)建立的雙向電泳方法進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳的建立 獲得的電泳圖譜蛋白聚焦效果良好，背景比較清晰，能檢測(cè)到223個(gè)蛋白點(diǎn)（圖1），但蛋白點(diǎn)數(shù)量較少，條件有待進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 一向等電聚焦程序優(yōu)化 按程序Ⅰ聚焦獲得的蛋白電泳圖譜中蛋白聚焦效果不完全，不夠清晰，數(shù)量明顯偏少，有豎條紋較多，能檢測(cè)到184個(gè)蛋白點(diǎn)，按程序Ⅱ聚焦獲得的蛋白聚焦效果好，邊界清晰分明，蛋白點(diǎn)較多，檢測(cè)到365個(gè)蛋白點(diǎn)（圖2）。

2.3 染色試劑優(yōu)化 經(jīng)典考馬斯亮蘭染色的電泳圖譜中蛋白點(diǎn)少，能檢測(cè)到75個(gè)蛋白點(diǎn)，而硝酸銀染色的電泳圖譜中蛋白點(diǎn)較多，蛋白點(diǎn)也比較清晰，能檢測(cè)到296個(gè)蛋白點(diǎn)（圖3）。

2.4 上樣量?jī)?yōu)化 當(dāng)上樣量為80μg時(shí)，電泳圖譜中蛋白點(diǎn)的數(shù)量明顯偏少,蛋白點(diǎn)也不夠清晰，能檢測(cè)到88個(gè)蛋白點(diǎn)；上樣量為120μg時(shí)，電泳圖譜中蛋白點(diǎn)有所增多，邊界比較分明，能檢測(cè)到154個(gè)蛋白點(diǎn)；上樣量為160μg時(shí)，電泳圖譜中蛋白點(diǎn)較多和清晰、邊界分明，能檢測(cè)到305個(gè)蛋白點(diǎn)；當(dāng)上樣量為200μg時(shí)電泳圖譜中蛋白點(diǎn)明顯點(diǎn)增多，邊界清晰，聚焦效果良好，能檢測(cè)到386個(gè)蛋白點(diǎn)（圖 4）。

圖4 不同上樣量對(duì)2DE電泳圖譜的影響Fig.4 Effects of different loaded protein on the 2-DEmaps of protein

2.5 顯色時(shí)間優(yōu)化 顯色4min的蛋白電泳圖譜中蛋白點(diǎn)較少，能檢測(cè)到278個(gè)蛋白，而顯色時(shí)間為6 Min的電泳圖譜中蛋白點(diǎn)較多，蛋白點(diǎn)也比較清晰，能檢測(cè)到375個(gè)蛋白點(diǎn)（圖5）。

2.6 HP-PRRSV培養(yǎng)物與MC-145細(xì)胞蛋白雙向電泳 HP-PRRSV-FJ06A培養(yǎng)物蛋白樣品電泳圖譜能檢測(cè)到103個(gè)蛋白點(diǎn)（圖6），MC-145細(xì)胞蛋白樣品聚焦效果良好，能檢測(cè)到89個(gè)蛋白點(diǎn)（圖7）。

3 討論

通過(guò)對(duì)HP-PRRSV大量培養(yǎng)、濃縮、樣品處理、上樣量、一向等電聚焦程序、染色試劑選擇和顯色時(shí)間等條件的優(yōu)化，建立了一套適合HP-PRRSV蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)方法，即以凍融-超聲-裂解病毒法提取蛋白質(zhì)樣品，采用7 cm pH3-10的IPG膠條，上樣品量為200μg，上樣體積為125μL，等電聚集的電壓為8 000 v，采用硝酸銀，結(jié)合Na2CO3與甲醛顯色6 min，能獲得了高分辨率的電泳圖譜，并將部分蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，鑒定到有高致病性PRRSV-NSP2蛋白、PRRSV-GP2蛋白、PRRSV-M蛋白和PRRSV-N蛋白等特異性蛋白。同時(shí)，采用相同方法對(duì)HP-PRRSV的培養(yǎng)物和MC-145細(xì)胞蛋白進(jìn)行雙向電泳，并獲得了蛋白電泳圖譜，但聚焦蛋白點(diǎn)偏少，可能與蛋白樣品的制備有關(guān)，因?yàn)椴捎孟嗤臉悠分苽浞椒ǎ琀PPRRSV的培養(yǎng)物被高度濃縮后，其含有的離子和鹽份等雜質(zhì)較多，影響了等電聚焦，而MC-145細(xì)胞蛋白樣品因經(jīng)過(guò)高速離心去除了較多的可溶性蛋白，致聚焦蛋白點(diǎn)較少。經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)表明，優(yōu)化的雙向電泳方法適用于HP-PRRSV，能獲得分辨率高、重復(fù)性好的電泳圖譜。

為提高HP-PRRSV的濃度和純度，對(duì)培養(yǎng)的HP-PRRSV采用超速離心方法進(jìn)行了濃縮。雖然大量培養(yǎng)病毒、濃縮病毒、裂解病毒顆粒相對(duì)復(fù)雜困難，但采用差速離心濃縮病毒，通過(guò)凍融-超聲-裂解樣品蛋白，破壞了病毒的囊膜和去除了核酸，結(jié)合2-D clean-up試劑盒純化蛋白，進(jìn)一步的去除了部分樣品中糖類、脂質(zhì)和鹽份等雜質(zhì)，提高了雙向電泳的效果。一向等電聚焦是雙向電泳中的關(guān)鍵步驟，聚焦效果的好壞將直接關(guān)系到蛋白分離的成敗[10]，采用長(zhǎng)時(shí)間逐步升壓方法有利于促進(jìn)蛋白樣品的溶解和除去鹽離子對(duì)聚焦效果的影響，并且高壓聚焦蛋白效果明顯比低壓更理想。樣品上樣量也是一個(gè)直接影響電泳比較重要的因素，若蛋白樣品量太低，導(dǎo)致電泳圖譜中有效蛋白點(diǎn)少，上樣量過(guò)高，很可能在聚焦的過(guò)程中有部分蛋白在膠條槽中沉淀凝固下來(lái)，堵塞凝膠孔徑，影響蛋白聚焦效果。染色試劑和顯色時(shí)間對(duì)蛋白電泳圖影響也較大，試驗(yàn)表明，硝酸銀染色比經(jīng)典考馬斯亮蘭染色敏感，這與邵錦震等報(bào)道的基本一致[11]。

本研究建立了HP-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳方法，能夠?yàn)镠P-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，更為開展HP-PRRSV蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫蛋白質(zhì)組學(xué)提供有力的技術(shù)支撐。

[1]Tian Ke-gong,Yu Xiu-ling,Zhao Tie-zhu,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and moleeular dissection of the unique hallmark[J].PLoSOne,2007,2（6）:e526.

[2]De Lima M,Pattnaik A K,Flores E F,et al.Serologic marker candidates identified among B-cell linear epitopes of NSP2 and structural proteins of a North Ameriean strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology,2006,353（2）:410-421

[3]童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29（5）：323-326.

[4]周倫江，王隆柏，王偉，等.變異豬繁殖與呼吸綜合征病毒FJ06A的分離鑒定和致病性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（6）：618-623.

[5]Wilkins MR,Sanchez J C,Gooley A A,et al.Progress with proteome p rojects:why all proteins exp ressed by a genome should be identified and how to do it[J].Biotechnol Genet Eng Rev,1996,13:19-50.

[6]Chelius D,Hühmer A F,Shieh C H,et al.Analysis of the adenovirus type 5 proteome by liquid chromatography and tandem mass spectrometry methods[J].J Proteome Res,2002,1（6）:501-513.

[7]Chertova E,Chertov O,Coren L V,et al.Proteomic and biochem ical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infectedmonocyte-derived macrophages[J].JVirol，2006,80（18）:9039-9052.

[8]張愛玲，王興龍，王英超，等.2型豬鏈球菌分泌組雙向電泳樣品制備方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（10）：776-779.

[9]張娜娜，許勤，李風(fēng)良，等.小菜蛾成蟲蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的建立及條件優(yōu)化[J].南京師大學(xué)報(bào)，2011，36（2）：78-82.

[10]Nagalla S R,Canick J A,Jacob T,et al.Proteom ic analysis of maternal serum in down syndrome:identification of novel protein biomarkers[J].JProteome Res,2007,6（4）:1245-1257.

[11]邵錦震，顧勇.水稻劍葉蛋白質(zhì)的雙向電泳分析[J].湖北師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（1）：1-5.