羅維玉，胡永浩，鄧國華，施建忠，丁晴微，王明芳，張文亮，陳化蘭*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001）

禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染/疾病綜合征。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）在野生水鳥、大多數(shù)家養(yǎng)水禽、海鷗、濱鳥中廣泛存在[1-2]。AIV基因組由8個獨(dú)立單股負(fù)鏈RNA節(jié)段組成，根據(jù)流感病毒血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原性的差異，將A型流感病毒分為16種HA亞型和9種NA亞型[3]。由于其基因組的分節(jié)段性以及復(fù)制過程中RNA聚合酶缺乏矯正功能，導(dǎo)致AIV變異頻繁，亞型組合眾多[4]。高致病性AIV H5、H7對養(yǎng)禽業(yè)的嚴(yán)重危害性和公共衛(wèi)生意義一直倍受關(guān)注。但低致病性AIV（LPAIV）同樣給養(yǎng)禽業(yè)造成損失。有研究指出，北美與歐洲部分地區(qū)的鴨群中H3、H4及H6亞型流感病毒的分離率最高[5]，近年在我國H6亞型出現(xiàn)的頻率也越來越高，并且有證據(jù)顯示已經(jīng)在人體中檢測到H6亞型AIV的抗體[6]，因此H6亞型LPAIV的公共衛(wèi)生學(xué)意義應(yīng)予以重視。本實(shí)驗(yàn)對兩株鵝源H6N2亞型AIV進(jìn)行全基因組的序列測定和相關(guān)的動物致病性試驗(yàn)，并研究其相關(guān)的生物學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動物 所有病毒株均由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、純化并保存；SPF雞胚及SPF雞均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心；BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs和分子量Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、LS TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司；BigDye Term inator測序試劑盒3.1 version購自ABI公司；完全佐劑、β-丙內(nèi)酯購自Sigma公司。

1.3 基因組分析

1.3.1 RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增采用LS TRIzol試劑盒，按說明書方法提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用膠回收試劑盒純化。

1.3.2 序列測定與分析采用BigDye Terminator測序試劑盒3.1 version，按照說明書進(jìn)行。利用DNAStar軟件中Seqman拼接序列，應(yīng)用MegAlign（By Clustal V Method）進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析，MEGA5（Construct/Testmaximum likelihood tree）繪制各基因片段的進(jìn)化樹。

1.4 抗原分析

1.4.1 制備免疫血清將病毒接種SPF雞胚48 h后，收取雞胚尿囊液，濃縮至血凝價7log2～8log2后與弗氏不完全佐劑1∶1混合，乳化后于雞肌肉多點(diǎn)注射免疫。一個月后采血分離血清。

1.4.2 交叉血凝抑制（HI）試驗(yàn)利用病毒及其特異性血清，按照OIE標(biāo)準(zhǔn)HI方法進(jìn)行交叉HI試驗(yàn)。

1.4.3 抗原差異性分析抗原差異r值的計算方法按照《動物病毒學(xué)》第二版的方法進(jìn)行。如果r值為1，表示兩株病毒的抗原性相同；如果0.67≤r≤1.5，表示兩株病毒間無明顯差異；0.5≤r≤0.67，表示兩株病毒間抗原性差異較?。籸<0.5，表示兩株病毒間差異顯著；r值越小表示抗原性差異越大。以此為依據(jù)劃分病毒抗原性分類。

1.5 動物感染試驗(yàn)

1.5.1 SPF雞感染試驗(yàn)按照每只雞106EID50/100μL的病毒量鼻腔接種13只SPF雞，另外兩只接種等體積PBS作為對照，于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。感染后連續(xù)8 d采集泄殖腔和喉頭拭子，并接種雞胚進(jìn)行病毒分離、滴度測定，分析其排毒規(guī)律。感染3 d后每株病毒采取3只雞的組織臟器（腦、胸腺、氣管、心、肝、脾、肺、腎、盲腸扁桃體、法氏囊）用于病毒分離滴定，感染21 d后采集血液，檢測血清陽轉(zhuǎn)情況。

1.5.2 BALB/c小鼠感染試驗(yàn)按照每只106EID50/50μL的病毒量鼻腔接種8只BALB/c小鼠，接種后第3 d剖殺3只，采集腦、鼻甲、脾、腎和肺用于病毒分離滴定；其余5只連續(xù)觀察14 d，并記錄體重變化情況。

2 結(jié)果

2.1 序列及進(jìn)化分析

2.1.1 HA基因的序列及進(jìn)化分析兩株病毒的HA基因開放閱讀框均為1 701 bp，編碼566個氨基酸殘基，均無堿基的插入和缺失，裂解位點(diǎn)339PQIETR↓GLFG348，具有典型的LPAIV的HA基因特征。存在8個潛在的糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser或Thr），其中6個位于HA1第26位、27位、39位、182位、306位和311位，2個位于HA2第498位和557位[7]。受體結(jié)合位點(diǎn)Q226G228，（以H3亞型病毒為參照）表明病毒偏向與和α-2,3連接的唾液酸結(jié)合，為禽類易感病毒的特異性氨基酸。HA基因進(jìn)化樹分為兩個大的分支，即歐亞系和北美系，兩株病毒均與北美系代表病毒株A/ruddy turnstone/Delaware/105/1998（H6N8）處于不同的分支，并且兩株病毒之間的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，分屬于兩個小的進(jìn)化分支，核苷酸同源性僅為84.5%，而且與香港、臺灣地區(qū)以及周邊國家（韓國、日本）的分離株同源性均在90%以下，相差較大（圖1）。

圖1 GD/362/09和GD/244/10的基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on GD/362/09 and GD/244/10

2.1.2 NA基因的序列及進(jìn)化分析NA開放閱讀框全長1 410 bp，編碼469個氨基酸，均無頸部缺失。8個潛在糖基化位點(diǎn)分別位于61位、69位、70位、86位、146位、200位、234位和402位[8]，氨基酸未發(fā)生H274K的突變，該位點(diǎn)的氨基酸對唾液酸苷酶抑制類藥物（如磷酸奧司他韋）敏感。進(jìn)化分析表明：兩株病毒NA基因均屬于歐亞系，核苷酸同源性為98.9%，表明具有共同的來源，除了與一株日本病毒株A/duck/Chiba/5/2007（H6N2）核苷酸同源性達(dá)到91.5%以外，與周邊其余國家的病毒株親緣關(guān)系均相差較遠(yuǎn)。

2.1.3 內(nèi)部基因的序列及進(jìn)化分析兩株病毒間內(nèi)部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS的核苷酸同源性分別為92.1%、92.6%、89.9%、91.6%、98.3%和93.3%。與GD/362/09株內(nèi)部基因片段同源性最高的均為汕頭H6N2分離株，而與GD/244/10的PA和M片段同源性最高的病毒株分別為A/aquatic bird/Korea/w74/2005（H5N2）和A/duck/Hong Kong/140/1998（H5N1），同源性分別達(dá)到96%和98.3%，其余片段同樣與汕頭分離株同源性最高（表1）；但兩株病毒的其他內(nèi)部基因片段與A/duck/Hong Kong/140/1998（H5N1）也有很高的同源性（91.5%～97.7%），表明這兩株病毒的內(nèi)部基因來源復(fù)雜，可能由H5病毒株進(jìn)化而來或與其擁有共同的來源。

2.2 病毒對SPF雞的感染試驗(yàn) SPF雞感染兩株病毒后均無明顯臨床癥狀，只有喉拭子檢測到病毒。感染21 d后血清檢測結(jié)果顯示：接種GD/244/10病毒株的雞血清轉(zhuǎn)陽比例為5/8，接種GD/362/09血清轉(zhuǎn)陽比例為1/8，而且同居對照組雞血清均呈陰性反應(yīng)。病毒滴定結(jié)果顯示：接種GD/244/10病毒株的雞群排毒期持續(xù)到第6 d，高峰期在第3 d；而接種GD/362/09病毒株的雞群，排毒期只持續(xù)到第3 d。喉拭子滴定結(jié)果與血清檢測結(jié)果一致，表明兩株病毒均不能夠在雞群間發(fā)生有效傳播，均只通過呼吸道排毒（表2）。臟器滴定結(jié)果表明，兩株病毒在所有臟器內(nèi)均不能復(fù)制。

表1 GD/362/09及GD/244/10各基因片段BLAST分析結(jié)果Table 1 The Blast analysis of genes of GD/362/09 and GD/244/10 influenza virus isolates

表2 病毒感染后的滴定結(jié)果Table 2 Virus titration after infection

2.3 病毒對BALB/c小鼠感染試驗(yàn) 106EID50鼻腔接種后，感染小鼠既無明顯臨床變化，也無明顯的體重變化。臟器滴定結(jié)果顯示：接種兩株病毒的小鼠肺臟滴定結(jié)果均呈陽性，其中只有接種GD/244/10的小鼠鼻甲也能夠分離到病毒，而在其他所有的臟器中則均未檢測到病毒（圖2）。

2.4 抗原分析結(jié)果 采用各自滅活疫苗免疫的特異性血清進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示：GD/362/09病毒株分別與兩株病毒的特異性血清的HI抑制價相差5 log2，GD/244/10病毒株分別與兩株病毒特異性血清的HI抑制價相差4 log2。兩株病毒之間的抗原性差異系數(shù)r值為0.59，表明兩株病毒的抗原差異性較大。

3 討論

本研究的兩株H6亞型鵝源病毒GD/362/09和GD/244/10，HA裂解位點(diǎn)的序列具有典型的LPALV的分子特征，核苷酸同源性僅為84.5%，表明其來源各不相同；NA基因與最近10年汕頭分離株同亞型的病毒株保持最高的同源性；PB2基因的627位和701位為病毒宿主范圍和復(fù)制能力以及跨種傳播的分子特征；PB1基因的198位和317位氨基酸與病毒在小鼠體內(nèi)的致病性相關(guān)；PA片段的97位和515位氨基酸也影響病毒的毒力，M片段的31位氨基酸與病毒金剛烷胺抗藥性密切相關(guān)，NS片段的92位和149位氨基酸的改變能夠影響病毒拮抗干擾素生成的能力，而本實(shí)驗(yàn)的兩株病毒各內(nèi)部基因片段均未發(fā)生使病毒毒力增強(qiáng)的相關(guān)突變（PB2片段：E158G、E627K、D701N；PB1片段：K198I、I317K、Y436H；PA片段：T97I、T515A；M片段：V31N；NS片段：D92E、V149A）[9]。

基因進(jìn)化關(guān)系顯示：兩株病毒的所有基因片段均屬于歐亞系，并沒有與北美系病毒株發(fā)生基因交換，與GD/244/10的PA和M片段同源性最高的均為H5 HPAIV，而且其他內(nèi)部基因均與A/duck/Hong Kong/140/1998（H5N1）的同源性相當(dāng)高，這與之前H6是H5亞型內(nèi)部基因供體的研究結(jié)論一致，表明H6已與H5 HPAIV發(fā)生重組，并且其內(nèi)部基因可能不停的在這兩個亞型之間傳遞和進(jìn)化[10]。水禽作為AIV的自然宿主，幾乎所有的H6亞型病毒均來自鴨源，而這兩株病毒均屬鵝源病毒，表明病毒在禽類宿主鴨、鵝、雞之間的跨種傳播已很普遍。通過從時間、空間、宿主以及亞型幾個方面的研究顯示，由于頻繁的活禽貿(mào)易往來以及全球范圍內(nèi)的候鳥遷徙等，使得不同地區(qū)、不同來源、不同生物學(xué)特性的病毒入侵的機(jī)會大大增加，H6亞型AIV已能夠跨越種間屏障并與H5 HPAIV發(fā)生重組，但重組的原因以及其進(jìn)化史仍需進(jìn)一步的研究。多元化和復(fù)雜化已是AIV的進(jìn)化趨勢，使我們對疫情的控制更加困難。有研究表明：H6亞型AIV在北美和歐亞大陸的野生水禽中廣泛流行，主要包括雁形目和鸻形目[11-13]，在我國H6亞型也是禽流感流行病學(xué)調(diào)查過程中分離數(shù)量最多的亞型之一，占所有AIV亞型的17.8%。因此，我們必須在加強(qiáng)對HPAIV監(jiān)測和研究的同時，增加對LPAIV生物遺傳進(jìn)化情況的研究。

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