余 樂，張思春，李 素，楊凡力，涂長春*

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122）

血管內(nèi)皮細(xì)胞為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞，它不僅在多種生理過程中發(fā)揮著重要的作用，而且在病原入侵時(shí)還是多種病毒如尼帕病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒等的靶細(xì)胞[1]。豬的血管內(nèi)皮細(xì)胞是豬瘟病毒（Classical sw ine fever virus，CSFV）的主要靶細(xì)胞，其感染可引起嚴(yán)重的、特征性出血性病理變化[2]。原代細(xì)胞保持了細(xì)胞在生物體內(nèi)時(shí)的大多數(shù)生理特征，與可在體外無限傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系相比，它們更真實(shí)地反映了正常生理?xiàng)l件下的細(xì)胞狀態(tài)及功能。因此利用原代血管內(nèi)皮細(xì)胞研究CSFV的致病機(jī)制具有重要意義。

雖然血管內(nèi)皮細(xì)胞可以從主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、臍東脈等大血管以及多種微血管中分離獲得[3-4]，但從臍靜脈中分離血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更多優(yōu)點(diǎn)。首先是臍帶取材容易，不需要宰殺動(dòng)物；其次是數(shù)量豐富，采集的單根臍帶長度可達(dá)20 cm以上，而從一窩新生小豬中可獲得多根臍靜脈血管。此外，臍靜脈血管比臍動(dòng)脈血管粗，內(nèi)徑大，柔韌性好，不會(huì)發(fā)生血管收縮，更容易操作。因此，對(duì)于需要大量制備豬原代血管內(nèi)皮細(xì)胞來而言，從臍靜脈分離是最佳選擇。

血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離方法主要有組織塊貼壁法、機(jī)械刮取法、灌注消化法和磁珠分離法。組織塊貼壁法是將血管切成組織塊后貼于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，讓內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊周圍長出來。機(jī)械刮取法則是用消毒棉簽或手術(shù)刀背等輕輕刮取血管的內(nèi)膜面來獲得內(nèi)皮細(xì)胞。這兩種方法一般可用于大血管的內(nèi)皮細(xì)胞的分離。灌注消化法通過將消化液灌注入血管內(nèi)腔，利用酶的消化作用使內(nèi)皮細(xì)胞與血管組織分離[5]。磁珠分離法則是利用特異的介質(zhì)（如表面有內(nèi)皮細(xì)胞特異單克隆抗體的磁珠）從含多種細(xì)胞的懸液中將內(nèi)皮細(xì)胞分離出來，多用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的進(jìn)一步純化[6]。

自Jaffe等建立灌注消化法以來，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的分離培養(yǎng)已有近40年的歷史[7]。灌注消化法也成為了獲得臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的最佳方法。可利用的消化酶有膠原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶（Dispase）[8]。膠原酶可分為Ⅰ型或Ⅱ型膠原酶。本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)操作過程進(jìn)行優(yōu)化，以建立簡單實(shí)用的豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（Sw ine umbilical vein endothelial cell，SUVEC）分離及培養(yǎng)方法，為豬瘟病毒研究提供大量的原代血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 臍帶、細(xì)胞和病毒株 新生健康長白豬臍帶采自長春市郊某豬場(chǎng)。PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬胎兒成纖維細(xì)胞（PEF）由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院歐陽紅生教授提供。CSFV石門株血毒（105.33TCID50/0.1m L）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 Ⅰ型膠原酶、M 199培養(yǎng)基、肝素和FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG均購自Sigma公司；胎牛血清購自PAA公司；內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物（Endothelial cell growth supplement，ECGS）購自 BD Biosciences公司；Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Acetylated Low Density Lipoprotein，Dil-Ac-LDL）購自Biomedical Technologies公司；兔抗人第VIII因子相關(guān)抗原多克隆抗體、羊抗兔IgG-Cy3抗體和正常山羊血清均購自武漢Boster公司。CSFV陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 SUVEC的分離培養(yǎng)及傳代 無菌采集新生仔豬臍帶，每根長約15 cm～20 cm，2 h內(nèi)分離血管內(nèi)皮細(xì)胞。在生物安全柜內(nèi)用止血鉗取出并夾住臍帶兩端，放入75%乙醇中浸泡2 min后轉(zhuǎn)入玻璃平皿內(nèi)，剪去兩端有夾痕的部分?？v向剝離臍帶組織，分離出臍靜脈血管（為臍帶的3根血管中最粗的1根），用注射器灌注PBS沖洗血管內(nèi)腔直到流出的液體清亮透明無血色為止。從血管一端灌注用M 199培養(yǎng)基配制的0.1%的Ⅰ型膠原酶溶液，下端有酶溶液開始漏出時(shí)用無菌細(xì)線結(jié)扎下端，繼續(xù)注入酶溶液至血管微微膨脹，結(jié)扎注液端，放入含PBS的一次性細(xì)菌培養(yǎng)皿中，封口膜密封后37℃水浴消化10 min。剪去血管兩端結(jié)扎處，用M 199培養(yǎng)基沖洗血管內(nèi)腔，收集所有的細(xì)胞懸液于離心管中，1 000 r/m in離心5 Min，棄上清，加入SUVEC完全培養(yǎng)基（含20%FBS、75μg/mLECGS、2mmol/L谷氨酰胺、100μg/mL肝素、100μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素的M 199培養(yǎng)基）懸浮細(xì)胞后移入100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，8 h后換液，以每2 d～3 d換液一次。將形成單層的內(nèi)皮細(xì)胞，0.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/L EDTA消化分散細(xì)胞，按1∶2的比例傳至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代。

1.4 SUVEC的鑒定

1.4.1 第Ⅷ因子相關(guān)抗原的鑒定將單層SUVEC細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定10 Min，0.2%Triton X-100 PBS處理10 Min，山羊血清室溫封閉30 Min，兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體4℃孵育過夜，二抗為羊抗兔IgG-Cy3抗體，37℃避光孵育30min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 細(xì)胞攝取Dil-Ac-LDL將SUVEC細(xì)胞、PK-15細(xì)胞（培養(yǎng)于含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)液中）及PEF（培養(yǎng)于含20%FBS、1 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中）分別培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)36 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL含10μg/mL Dil-Ac-LDL的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞生長曲線的繪制 將長滿單層的第二代內(nèi)皮細(xì)胞，胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至105個(gè)/mL，接種于24孔板，每孔500μL。每24 h分別取3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，繪制生長曲線。

1.6 SUVEC對(duì)CSFV易感性試驗(yàn) 將第二代SUVEC消化后計(jì)數(shù)，以1×104/孔的數(shù)量接種96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，接種CSFV石門株血毒，分別接種 2×103、1×103、5×102、2×102、102個(gè)TCID50/孔，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)取PK-15細(xì)胞進(jìn)行相同的處理。37℃吸附1 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)感染CSFV的細(xì)胞比例[9]。

2 結(jié)果

2.1 原代SUVEC的分離及培養(yǎng) 在相差顯微鏡下連續(xù)觀察，原代血管內(nèi)皮細(xì)胞在接種3 h～4 h后開始貼壁，多數(shù)細(xì)胞以團(tuán)狀形式存在，各團(tuán)細(xì)胞的數(shù)目在幾個(gè)至幾十個(gè)不等，少數(shù)以單個(gè)細(xì)胞的形式存在。在培養(yǎng)8 h后換液時(shí)，細(xì)胞已完全貼壁，此時(shí)的細(xì)胞呈扁平圓形或短梭形，中央有卵圓形的核，折光性好。12 h后細(xì)胞開始迅速生長，在細(xì)胞團(tuán)周圍有大量細(xì)胞生長形成小島狀細(xì)胞集落，并能在2 d～4 d內(nèi)形成細(xì)胞單層。單層的細(xì)胞呈典型的鵝卵石樣鑲嵌排列，形態(tài)均一、排列緊密（圖1A）。

2.2 SUVEC的傳代培養(yǎng) 將原代SUVEC進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，第2代～6代的細(xì)胞在接種于培養(yǎng)皿后貼壁和生長速度較快，接種后4 h大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，大約36 h長滿單層（圖1B）。第6代以后的SUVEC生長速度逐漸減慢，長滿單層的時(shí)間延長，并且單層的細(xì)胞密度減小。細(xì)胞最多可培養(yǎng)至第10代，此時(shí)的細(xì)胞已不能長滿單層，并且體積大、雙核及多核的細(xì)胞較多，細(xì)胞表現(xiàn)出衰老細(xì)胞的典型特征，因此不能繼續(xù)傳代。體外培養(yǎng)的SUVEC存在接觸抑制，當(dāng)它們以單層狀態(tài)再保持一定時(shí)間時(shí)，細(xì)胞彼此間接觸更緊密，但并不表現(xiàn)出重疊或者堆積生長的趨勢(shì)。

2.3 SUVEC的鑒定

2.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)第Ⅷ因子相關(guān)抗原是鑒定內(nèi)皮細(xì)胞最常用的標(biāo)志[10]。熒光顯微鏡下觀察，在原代、第4代及第8代細(xì)胞的胞漿中可檢測(cè)到大量第Ⅷ因子相關(guān)抗原特異性紅色熒光，第Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性率均接近100%（圖2），而陰性對(duì)照無紅色熒光，表明這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的第Ⅷ因子相關(guān)抗原。

圖2 SUVEC第4代第Ⅷ因子IFA檢測(cè)（×100）Fig.2 Detection of vWF in SUVEC by indirect immunofluorescence at passage 4（100×）

2.3.2 內(nèi)皮細(xì)胞攝取Dil-Ac-LDL鑒定只有內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可大量攝取Dil-Ac-LDL，因此Dil-Ac-LDL常用于鑒定和分離內(nèi)皮細(xì)胞[11]。原代細(xì)胞、第3代、第8代細(xì)胞經(jīng)Dil-Ac-LDL處理后，在熒光顯微鏡下觀察核周可見大量明亮的紅色熒光，陽性細(xì)胞率近100%（圖3）。而對(duì)照的PEF和PK-15細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線的繪制 為了檢測(cè)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長特性繪制了SUVEC生長曲線（圖4）。圖4結(jié)果顯示，第3代內(nèi)皮細(xì)胞在接種后延遲期小于1 d，細(xì)胞完成貼壁。第2 d開始生長速度加快，細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，持續(xù)時(shí)間約為3 d。第5 d～6 d細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定，處于平臺(tái)期。第7 d細(xì)胞開始死亡脫落，細(xì)胞數(shù)目迅速減少。

2.5 CSFV感染SUVEC試驗(yàn)結(jié)果 相差顯微鏡下觀察，CSFV感染內(nèi)皮細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變，與感染PK-15細(xì)胞的特性完全一致。進(jìn)一步用IFA方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞和PK-15細(xì)胞接種病毒48 h后的感染情況。結(jié)果顯示，接種102TCID50病毒量的內(nèi)皮細(xì)胞感染率達(dá)50%左右，而接種相同量病毒的PK-15細(xì)胞感染率僅為25%左右。接種5×102TCID50病毒量的內(nèi)皮細(xì)胞感染率已達(dá)80%以上，而PK-15細(xì)胞接種病毒量需達(dá)到103才能達(dá)到相同的感染率。在接毒量為2×103TCID50時(shí)，兩種細(xì)胞的感染率均達(dá)到90%以上（圖5）。

3 討論

灌注消化法用于分離HUVEC已有近40年的歷史[12]，并逐漸成為分離HUVEC的最佳途徑。我們借鑒分離培養(yǎng)HUVEVC的諸多經(jīng)驗(yàn)[5,8]，對(duì)灌注消化法進(jìn)行一定的改進(jìn)，使之更適合于SUVEC的分離培養(yǎng)。原有的灌注消化法直接在臍帶中對(duì)靜脈血管進(jìn)行殘留血液的沖洗、消化液的灌注及內(nèi)皮細(xì)胞的收集。本方法則先分離出靜脈血管，然后直接對(duì)靜脈血管進(jìn)行處理。與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，在處理多根臍帶時(shí)，本方法既減小了操作對(duì)象的體積，所需的工具也更少更簡單，可有效降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。其次，直接對(duì)靜脈血管進(jìn)行各種液體的灌注比對(duì)整根臍帶進(jìn)行灌注更加方便。最終，可直觀地觀察血管內(nèi)殘血是否已洗盡，確保酶與細(xì)胞充分接觸，使消化作用均勻有效。

灌注消化法分離血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)多使用胰蛋白酶、膠原酶，其中以Ⅰ型膠原酶最好。與胰蛋白酶相比，膠原酶具有作用溫和、對(duì)細(xì)胞損傷小的優(yōu)點(diǎn)，而且鈣、鎂離子和血清對(duì)膠原酶的活性沒有影響。本實(shí)驗(yàn)以M 199培養(yǎng)基代替磷酸鹽緩沖液配制膠原酶溶液，可進(jìn)一步減小酶的消化作用對(duì)細(xì)胞的損傷。灌注膠原酶的靜脈血管在37℃水浴中消化10 Min即可分離出大量的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)塊。消化更長時(shí)間可獲得更多的細(xì)胞，但也增加了平滑肌細(xì)胞和PEF污染的機(jī)率，并且容易破壞血管壁，造成消化液外漏，也影響后續(xù)的細(xì)胞沖洗和收集。

內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)生長環(huán)境要求苛刻，體外培養(yǎng)困難，需要添加ECGS、肝素、胰島素等[5]。ECGS含有多種細(xì)胞生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子α和β[13]。肝素可以穩(wěn)定ECGS多肽構(gòu)象維持其的生物活性[14]。在培養(yǎng)基中加入ECGS和肝素可以明顯地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長及細(xì)胞活力，進(jìn)而增加內(nèi)皮細(xì)胞在體外的培養(yǎng)代數(shù)。采用本研究所配制的完全培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞能在2 d～4 d內(nèi)長滿單層。而不添加ECGS和肝素時(shí)原代細(xì)胞一般需培養(yǎng)6 d～8 d才能長滿單層[5]。前5代～6代的傳代細(xì)胞生長迅速，每36 h左右就需要再次傳代，此后細(xì)胞生長速度開始減慢，傳代時(shí)間逐漸變長，直到細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)而不能再進(jìn)行分裂，總共可在體外培養(yǎng)10代左右。根據(jù)CSFV感染SUVEC結(jié)果顯示，SUVEC比PK-15細(xì)胞對(duì)CSFV更敏感，有利于進(jìn)行CSFV感染的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[15]。

內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征呈多角形，單層鋪路石狀排列，而可能污染的PEF和平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)長狀，平行排列，并能形成重疊層[12]。用于鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志包括CD31、CD34、ICAM-1（Intercellular adhesion molecule-1）、VCAM-1（Vascular cell adhesion molecule-1）、第Ⅷ因子相關(guān)抗原等[11]。第VIII因子相關(guān)抗原，又稱為Von Wellibrand因子，只表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中。此外，只有內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠攝取Dil-Ac-LDL低密度脂蛋白，Dil-Ac-LDL被溶酶體降解后，其親脂性的Dil分子聚集在溶酶體膜中，在549nm激發(fā)光下呈現(xiàn)紅色熒光。本方法所分離培養(yǎng)的細(xì)胞在相差顯微鏡下呈典型的單層鋪路石樣排列，第Ⅷ因子相關(guān)抗原和Dil-Ac-LDL攝取均為陽性，陽性率均可高達(dá)100%，證明所獲得的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

本方法具有良好的重復(fù)性，操作簡便并且可有效防止細(xì)菌污染。本方法也可應(yīng)用于其它動(dòng)物臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞或其它類型血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量分離和體外培養(yǎng)，為以內(nèi)皮細(xì)胞為材料的各種研究提供了一種可靠的操作方法及細(xì)胞鑒定方案。

[1]Valbuena G,Walker D H.The endothelium as a target for infections[J].Annu Rev Pathol,2006,1:171-198.

[2]Campos E,Revilla C,Chamorro S,et al.In vitroeffect of classical swine fever virus on a porcine aortic endothelial cell line[J].Vet Res,2004,35（6）:625-633.

[3]Wu Zhen-hua,Hofman,Zlokovic B V.A simplemethod for isolation and characterization of mouse brain Microvascular endothelial cells[J].JNeurosciMeth,2003,130（1）:53-63.

[4]Kajimoto K,Hossen MN,Hida K,et al.Isolation and culture of Microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues[J].J Immunol Meth,2010,357（1-2）:43-50.

[5]Baudin B,Bruneel A,Bosselut N,et al.A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[J].Nat Protoc,2007,2（3）:481-485.

[6]孫振朕，蔡在龍，朱科明，等.小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞磁珠分選法分離和原代培養(yǎng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（50）：9366-9369.

[7]Jaffe E A,Nachman R L,Becker C G,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest,1973,52（11）:2745-2756.

[8]Mano Y,Sawasaki K,Takahashit,et al.Cultivation of arterial cells from human umbilical cord[J].Experientia,1983,39（10）:1144-1146.

[9]徐興然，郭煥成，史子學(xué)，等.通過基因組定量研究豬瘟病毒在細(xì)胞中的增殖特性[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47（5）：800-804.

[10]Beekhuizen H,van Furth R.Grow th characteristics of cultured human macrovascular venous and arterial and microvascular endothelial cells[J].JVasc Res,1994,31（4）:230-239.

[11]Voyta JC,Viad P,Butterfield C E,et al.Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein[J].JCell Biol,1984,99（6）:2034-2040.

[12]Nachman R L,Jaffe E A.Endothelial cell culture:beginnings of modern vascular biology[J].JClin Invest,2004,114（8）:1037-1040.

[13]Maciag T,Cerundolo J,Ilsley S,et al.An endothelial cell growth factor from bovine hypothalamus:identification and partial characterization[J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76（11）:5674-5678.

[14]Schreieber A B,Kenney J,KowalskiW J,et al.Interaction of endothelial cell growth factor w ith heparin:characterization by receptor and antibody recognition[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82（18）:6138-6142.

[15]Li Su,Qu Hui,Hao Jian-wei,et al.Proteomic analysis of primary porcine endothelial cells after infection by classical swine fever virus[J].Biochim Biophys Acta,2010,1804（9）:1882-1888.