李喬晶，張九州，楊 霞，常洪濤，王 珊，皇甫和平，姚惠霞，迪麗拜爾·阿木提，王川慶*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院/禽病研究所動物傳染病實驗室，河南鄭州 450002；2.新疆阿克蘇職業(yè)技術(shù)學院，新疆阿克蘇 843000）

雞桿菌屬（Gallibacterium）是巴氏桿菌科成員，該屬包括溶血性巴氏桿菌（Pasteurella Haemolytica）、輸卵管炎放線桿菌（Actinobacillus salpingitidis）、鴨巴氏桿菌（P.anatis）、鴨源雞桿菌（G.anatis）、虎皮鸚鵡雞桿菌（G.melopsittaci）、海藻糖發(fā)酵雞桿菌（G.trehalosifermentans）和輸卵管炎雞桿菌（G.salpingitidis）7個種，其代表種是鴨源雞桿菌[1-3]。鴨源雞桿菌有溶血性鴨源雞桿菌（G.anatis haemolytica，GAH）和鴨子鴨源雞桿菌（G.anatis anatis）兩個生物變型，而GAH在家禽的生殖系統(tǒng)內(nèi)普遍存在，能引起產(chǎn)蛋雞群的輸卵管炎和腹膜炎[4-6]。目前，對于雞桿菌尚缺乏有效的治療藥物，而且在雞桿菌感染雞群中治療失敗時有發(fā)生[3]。國內(nèi)外學者曾對不同雞群中雞桿菌的感染情況及其分離物特性進行過詳細報道[1-7]，而關(guān)于雞桿菌對雛雞的感染性和致病性目前尚不清楚。因此，本實驗用從自然病例分離純化的雞桿菌人工感染4日齡SPF雛雞，通過形態(tài)學、PCR、熒光定量PCR和ELISA等方法分別對感染后SPF雛雞的組織臟器和血清進行細菌分離鑒定和抗體水平檢測，以便為雞桿菌的流行病學、致病機理及防治研究等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌 株 雞桿菌菌株（YU-PDS-RZ-1-SLG）由本實驗室從某地自然感染雞桿菌病雞的輸卵管中分離鑒定。取凍干菌種接種于血平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～20 h，挑取單個菌落接種于含5%犢牛血清的LB肉湯，37℃振搖培養(yǎng)18 h～20 h，進行平板菌落計數(shù)。

1.2 主要試劑 綿羊血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、10×Buffer、dNTP、SYBR GreenⅠ染料均購自日本TaKaRa公司；自制鴨源雞桿菌超聲波裂解抗原；TMB、辣根過氧化物酶標記兔抗雞IgG抗體（酶標二抗）均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K購自Merck公司；細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗動物 20只1日齡SPF雛雞購自乾元浩鄭州生物藥廠，隔離飼養(yǎng)，2日齡和3日齡時采人工感染組8只SPF雛雞上顎裂和泄殖腔的棉拭子接種于血平板，均未檢測出雞桿菌。

1.4 感染試驗 4日齡時，將20只SPF雛雞隨機分為3組：人工感染組8只，接種量為每只雞腹腔注射雞桿菌培養(yǎng)液0.5 ML（1.4×106cfu）；陰性對照組6只，腹腔注射等量的無菌液體LB；同居組6只，不作處理。

1.5 臨床觀察 人工感染后觀察SPF雞臨床癥狀、精神狀況、飲水進食等情況。

1.6 人工感染組雞與同居組雞的細菌分離與PCR鑒定

1.6.1 細菌分離人工感染后第2 d開始連續(xù)90 d每日無菌采取人工感染組和對照組雛雞上顎裂和泄殖腔的棉拭子接種于血平板分離細菌，從人工感染組分離出雞桿菌后將同居組與人工感染組一起飼養(yǎng)，同時對同居組進行細菌分離。

1.6.2 PCR鑒定對分離純化出的雞桿菌用煮沸法[7]提取基因組DNA作為PCR反應的模板，參考文獻[8-10]合成引物，序列如下：

其中rpoB-F和rpoB-R擴增的目的片段為560 bp；1133fgal和114r分別為雞桿菌16S rRNA和23S rRNA基因特異性引物，擴增16S rRNA和23S rRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)間（ITS）的核酸序列，根據(jù)雞桿菌中含1個或2個核糖體操縱子，擴增的2個片段分別為 790 bp、1 030 bp或 1 080 bp。

50μL PCR體系，反應程序為：95℃ 4 Min，25個循環(huán)，每個循環(huán)的反應參數(shù)：95℃30 s、55℃1min、72℃ 2m in， 72℃ 10 Min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 抗體檢測 人工感染第3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、35 d、47 d、60 d、75 d、88 d、96 d采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測血清的抗體水平。

1.8 病料中細菌的熒光定量PCR檢測 根據(jù)Gene-Bank中雞桿菌GtxA基因序列，應用Primer Express軟件設計合成熒光定量PCR引物，擴增片段為129bp，送鄭州博興生物科技有限公司合成。引物序列如下：

實驗雞于感染第96 d迫殺并采集心、肝、脾、肺、氣管、十二指腸等組織進行細菌分離與熒光定量PCR檢測。

1.9 組織病理學檢查 采取人工感染組雞的肝臟、肺臟和氣管等組織，10%中性福爾馬林緩沖液處理，制作病理切片，HE染色，進行常規(guī)的組織學檢查。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 人工感染SPF雞未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和肉眼損傷，同居組SPF雞和對照組SPF雞也沒有觀察到明顯的臨床癥狀和肉眼損傷；SPF雞精神狀況良好，飲水進食情況基本正常。

2.2 細菌的分離與PCR鑒定 在整個實驗過程中，陰性對照組SPF雞均未分離出雞桿菌。人工感染組與同居組分別在人工感染后第3 d、同居第2 d持續(xù)到人工感染第96 d（即SPF雞99日齡）迫殺可以連續(xù)從上顎裂分離出雞桿菌；分離純化出的雞桿菌經(jīng)特異PCR檢測為陽性（圖1）。

2.3 ELISA檢測的SPF雞血清抗體水平 檢測結(jié)果表明，人工感染組與同居組SPF雞抗體分別在人工感染后47 d和同居后32 d出現(xiàn)抗體高峰，而且僅持續(xù)2周～4周（圖2）。從圖2可以看出，人工感染組與同居組的抗體消長曲線基本一致，而且均高于對照組，差異顯著（p<0.05）；另外，在人工感染60 d時，人工感染組和同居組抗體滴度達到峰值。

2.4 不同組織內(nèi)細菌分離和定量分析 剖檢后心臟、肝臟、脾臟、肺臟、氣管、十二指腸等組織內(nèi)進行細菌分離和熒光定量PCR檢測，對照組SPF雞體內(nèi)未分離出雞桿菌，熒光定量PCR檢測結(jié)果為陰性；人工感染組與同居組SPF雞體內(nèi)均分離出雞桿菌，熒光定量PCR檢測組織結(jié)果為陽性，通過定量結(jié)果可以看出，氣管內(nèi)細菌含量最高，達到106個/mg（表 1）。

2.5 不同組織的病理學檢查 人工感染組雞的肝臟、肺臟和氣管均可見微觀損傷。接種鴨源雞桿菌的雞可見氣管上皮淋巴細胞浸潤，間質(zhì)性肺炎、支氣管杯狀細胞增生和支氣管淋巴結(jié)增生，肺臟炎癥細胞浸潤（圖3和圖4），肝實質(zhì)中有淋巴細胞和異嗜性白細胞浸潤，肝細胞多病灶壞死，膽管增生，肝臟血管周圍炎癥細胞浸潤。

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于鴨源雞桿菌對SPF雛雞的致病性研究鮮有報道，本研究選擇SPF雛雞為試驗動物，采用人工感染方法對雞桿菌的感染特性進行了初步研究。雞桿菌的宿主非常廣泛，除雞外，鴨、鴿、雉、鷓鴣、鸚鵡和鵝等均易感[11-12]，給養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟損失。Bojesen等將鴨源雞桿菌腹腔注射于商品雞，正常免疫狀態(tài)下，在接種部位表現(xiàn)出不同程度的局部化膿性腹膜炎，而免疫抑制雞的整個腹膜甚至連腹腔器官都呈現(xiàn)出化膿性腹膜炎[13]，這與先前描述的自然感染結(jié)果相似，可以成為雞桿菌毒力因子和發(fā)病機制研究的有用感染模型，因此本試驗的接種途徑選擇了腹腔接種。

表1 SPF雞不同組織內(nèi)細菌分離和熒光定量檢測比較Table 1 Comparison of bacteria isolation and fluorescence quantitative detection in SPF chickens'different organs

圖3 雞感染鴨源雞桿菌的微觀損傷（肺臟，炎癥細胞浸潤）Fig.3 Microscopic lesions in Gallibacterium anatis infected chicken（Lung,infiltration of lymphocytic inflammatory cells）

圖4 雞感染鴨源雞桿菌的微觀損傷（肺臟,炎癥細胞浸潤）Fig.4 Microscopic lesions in Gallibacterium anatis infected chicken（Lung,infiltration of lymphocytic inflammatory cells）

有文獻報道，腹腔注射溶血性巴氏桿菌（目前已經(jīng)劃分為雞桿菌屬）不感染1日齡雛雞，而且溶血性巴氏桿菌僅能從大于4周齡的雞體內(nèi)分離出來[11]，但本實驗的結(jié)果表明，SPF雛雞在4日齡時即可人工感染雞桿菌，這與以往的報道不一致。本實驗將鴨源雞桿菌接種于SPF雞，沒有明顯的眼觀癥狀，然而組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，在所有感染雞中，氣管、肺、氣囊和肝臟出現(xiàn)了不同程度的病理損傷，與Zepeda等[14]的研究結(jié)果一致。

雞桿菌血清抗體ELISA檢測結(jié)果中，對照組在第一次檢測時，抗體水平就較高，可能是非特異性吸附的結(jié)果；檢測結(jié)果表明雞桿菌抗體產(chǎn)生很慢，直到人工感染后35 d才可檢測到，而且持續(xù)時間很短，僅為2～4周，這與沙門氏菌、巴氏桿菌等病原的免疫特點很相似[15-16]。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，人工感染組和同居組SPF雞的氣管內(nèi)細菌含量最高，這可能是SPF雞通過排菌二次感染、呼吸道水平傳播所致；盡管本實驗通過腹腔注射人工感染SPF雞，但從肝臟中也分離出了鴨源雞桿菌，此外組織學檢查的肝臟損害等均表明鴨源雞桿菌可能引起菌血癥，通過血液而傳播至全身，這與Zepeda等[14]報道的一致。由于菌血癥可使細菌從泄殖腔排出[7]，從而導致二次感染。另外，對于同居感染雞究竟是經(jīng)呼吸道還是消化道感染，或者是兩者兼而有之尚不清楚，有待進一步研究。

致謝：感謝河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所的老師和同學提供的技術(shù)支持與幫助，感謝賀秀媛老師與其學生提供的幫助。

[1]Christensen H,Bisgaard M,Bojesen A M,et al.Genetic relationships among avian isolates classified asPasteurella haemolytica,'Actinobacillus salpingitidis'orPasteurella anatisw ith proposal ofGallibacterium anatisgen.nov.,comb.nov.and description of additional genomospecies withinGallibacteriumgen.nov[J].Int JSyst Evol Microbiol,2003,53:275-287.

[2]Bisgaard M,Korczak B,Busse H,et al.Classification of the taxon 2 and taxon 3 complex of Bisgaard w ithinGallibacteriumand description ofGallibacterium melopsittacisp.nov.,Gallibacterium trehalosifermentanssp.nov.andGallibacterium salpingitidissp.nov[J].Int J Syst Evol Microbiol,2009,59:735-744.

[3]Bojesen A M,Vazquez ME,Bager R J,et al.Antim icrobial susceptibility and tetracycline resistance determinant genotyping ofGallibacteriumanatis[J].Vet Microbiol,2011,148（1）:105-110.

[4]Bojesen A M,Christensen H,Nielsen O L,et al.Detection ofGallibacteriumspp.in chickens by fluorescent 16S rRNAin situhybridization[J].JClin Microbiol,2003,41（11）:5167-5172.

[5]Jordan F T W,W illiams N J,Wattret A,et al.Observations on salpingitis peritonitis and salpingoperitonitis in a layer breeder flock[J].Vet Rec,2005,157:573-577.

[6]Neubauer C,De Souza-Pilz M,Bojesen A M,et al.Tissue distribution of haemolyticGallibacterium anatisisolates in laying birds w ith reproductive disorders[J].Avian Pathol,2009,38（1）:1-7.

[7]鄭鹿平，楊霞，陳陸，等.45株雞卡氏桿菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)學報，2010，30（3）：347-351.

[8]Korczak B,Christsen H,Em ler S,et al.Phyolgeny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences[J].Int JSyst Evol Microbiol,2004,54:1393-1399.

[9]Bojesen A M,Vazquez ME,Robles F,et al.Specific identification ofGallibacteriumby a PCR using primers targeting the 16S rRNA and 23S rRNA genes[J].Vet Microbiol,2007,123:262-268.

[10]HuangFu He-ping,Wang Chuan-qing,Chen Lu,et al.Molecular Identification ofGallibacteriumfrom Hen and Analysis of Its 16S rRNA Gene[J].Agricul Sci Techn,2009,10（1）:43-46,55.

[11]Bisgaard M.Incidence ofPasteurella haemolyticain the respiratory tract of apparently healthy chickens and chickens with infectious bronchitis.characterisation of 213 strains[J].Avian Pathology,1977,6（4）:285-292.

[12]Addo P B,Mohan K.AtypicalPasteurella haemolyticatype A from poultry[J].Avian Dis,1984,29（5）:214-217.

[13]Bojesen A M,Nielsen O L,Christensen JP,et al.In vivostudies ofGallibacterium anatisinfection in chickens[J].Avian Pathol,2004,33（2）:145-152.

[14]Zepeda V A,Calderon-Apodaca N L,Paasch ML,et al.Histopathologic findings in chickens experimentally infected withGallibacterium anatisby nasal instillation[J].Avian Dis,2010,54（4）:1306-1309.

[15]劉軍，劉家彥，宋克磊，等.人工感染雞白痢菌抗體消長規(guī)律的試驗研究[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2006，5：16-17.

[16]劉亞剛，劉內(nèi)生，岳華，等.安寧河流域鴨瘟、鴨霍亂綜合防制研究-免疫鴨體內(nèi)巴氏桿菌抗體消長規(guī)律[J].中國獸醫(yī)學報，1998，1：60-63.