江德富 浙江省溫嶺市第二人民醫(yī)院 臺州 317500

童夏生 浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 羅冬嬌 亢曉冬 杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院

葉 輝 浙江省臺州市第一人民醫(yī)院 范廣民 陳 琪 浙江省臺州市中心醫(yī)院

哮喘大鼠TLR1、FasL和TRAF2表達(dá)及甲基強的松龍干預(yù)作用

江德富 浙江省溫嶺市第二人民醫(yī)院 臺州 317500

童夏生 浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 羅冬嬌 亢曉冬 杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院

葉 輝 浙江省臺州市第一人民醫(yī)院 范廣民 陳 琪 浙江省臺州市中心醫(yī)院

目的：探討TLR1、FasL和TRAF2在大鼠哮喘炎癥機(jī)制中的作用，觀察甲基強的松龍對其表達(dá)的影響。方法：27只SD大鼠，隨機(jī)分成哮喘模型組、正常對照組和甲基強的松龍組，每組9只，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血淋巴細(xì)胞TLR1和FasL表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TRAF2表達(dá)。結(jié)果：哮喘組血淋巴細(xì)胞TLR1表達(dá)水平顯著低于甲基強的松龍組（P＜0.05），正常對照組血淋巴細(xì)胞TLR1表達(dá)水平分別與哮喘組及甲基強的松龍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。哮喘組和甲基強的松龍組血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平均顯著高于正常對照組（P均＜0.05），而哮喘組血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平與甲基強的松龍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。哮喘組TRAF2光密度值顯著高于正常對照組和甲基強的松龍組（P均＜0.01），甲基強的松龍組TRAF2光密度值與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：哮喘模型大鼠FasL和TRAF2表達(dá)增加，而TLR1無變化；甲基強的松龍能下調(diào)TRAF2和提升TLR1水平，從而起到抗炎作用。

大鼠 哮喘 TLR1 FasL TRAF2 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 糖皮質(zhì)激素

炎癥細(xì)胞和炎癥因子在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用，尤其是淋巴細(xì)胞在調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡中起了決定性作用［1］。Toll樣受體（TLR）是聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫的重要分子，其信號系統(tǒng)可能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1和（或）Th2型細(xì)胞因子從而參與哮喘的炎癥過程。FasL是Fas的天然配體，參與細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。故研究TLR和FasL在淋巴細(xì)胞上的表達(dá)，對進(jìn)一步探討淋巴細(xì)胞在哮喘炎癥機(jī)制中的作用有著深遠(yuǎn)意義。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumornecrosisfactorreceptorassociated factor，TRAF）是TNF超家族成員之一，不僅能增強TNFR誘導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生，增強TNFR1-TNFR2的協(xié)同作用［2］，還與炎癥細(xì)胞的分化有關(guān)［3］，介導(dǎo)機(jī)體自然免疫和獲得性免疫。最近發(fā)現(xiàn)，TRAF1還與Th1/Th2平衡有關(guān)，它能抑制Th2炎性反應(yīng)［4］。但TRAF2在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用如何，目前知之甚少。本研究通過觀察哮喘大鼠TLR1、FasL和TRAF2的表達(dá)及甲基強的松龍對其影響，探討其在哮喘發(fā)病中的可能作用機(jī)制，為哮喘的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雞卵白蛋白（OVA）Ⅴ級購自美國Sigma公司，小鼠抗大鼠TRAF2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠TLR1-FITC和FasL-FITC抗體均購自上海研吉生物科技有限公司。即用型SP系列檢測試劑盒（其中試劑B：生物素標(biāo)記二抗工作液選用SP-9000）及DAB顯色劑（ZLI-9018）均購自北京中山生物有限公司。

1.2 實驗動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠27只，4～5周齡，體質(zhì)量（121±7）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供［許可證號：SCXK（滬）2007-0005］，在杭州師范大學(xué)實驗動物中心清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫20～25℃，濕度40%～60%，自主飲水、進(jìn)食。隨機(jī)分成哮喘組、正常對照組、甲基強的松龍組，每組9只。

1.3 動物模型復(fù)制［5］第1天和第8天腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液2mL［含OVA 1mg和Al（OH）3100mg］致敏，各1次。第15天開始每天向大鼠噴霧（空氣壓縮霧化器：PARI BOY-037G6000 GERMANY）1%OVA 30min，連續(xù)激發(fā)7天。表現(xiàn)為煩躁不安、搔癢、喘鳴、腹肌抽搐等癥狀。對照組致敏和激發(fā)均以生理鹽水替代OVA和Al（OH）3。甲基強的松龍組處理基本同哮喘組，但在每次抗原激發(fā)前30min給予腹腔注射甲基強的松龍4mg/只（輝瑞公司生產(chǎn)，批號X02247）。

1.4 血和肺組織標(biāo)本制備 末次激發(fā)24h后，10%水合氯醛（400mg/kg）大鼠腹腔注射麻醉，心臟抽血1mL（EDTA抗凝）待檢TLR1和FasL。取右內(nèi)側(cè)帶肺組織，4%多聚甲醛-PBS溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用免疫組化SP法測定TRAF2的表達(dá)。

1.5 血淋巴細(xì)胞TLR1、FasL的表達(dá) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，操作步驟：分別取EDTA抗凝全血100μL，加入2個試管，各自分別加入10μL TLR1-FITC 或10μL FasL-FITC、室溫下避光孵育20min，加入紅細(xì)胞裂解液1mL，室溫避光放置15～20min，振蕩混勻，1500r/min離心5min，棄上清，用2mL PBS洗滌1次，加入400μL PBS重新浮懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀測定:流式細(xì)胞儀經(jīng)常規(guī)校正，F(xiàn)LOW CHECK cv值＜2，根據(jù)前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，分別測定TLR1-FITC和FasL-FITC占的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。并收集10 000個細(xì)胞，同時設(shè)陰性對照。

1.6 免疫組化結(jié)果判定 光鏡下觀察細(xì)胞著色情況，蛋白定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色表達(dá)，結(jié)構(gòu)清晰，著色明顯高于背景。每張切片隨機(jī)選擇5個細(xì)支氣管，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統(tǒng)對陽性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度值（OD值）。

2 結(jié) 果

2.1 各組血淋巴細(xì)胞TLR1表達(dá) 哮喘組血淋巴細(xì)胞TLR1表達(dá)水平顯著低于甲基強的松龍組（P＜0.05），正常對照組血淋巴細(xì)胞TLR1表達(dá)水平與哮喘組及甲基強的松龍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1、圖1。

表1 各組血淋巴細(xì)胞TLR1和FasL表達(dá)水平（±s）

表1 各組血淋巴細(xì)胞TLR1和FasL表達(dá)水平（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與哮喘組比較，△P＜0.05

n/只TLR1（MFI）FasL（MFI）組 別8 8 7 49.23±4.06 47.58±1.46 52.89±3.92△11.73±1.39 15.52±0.53*14.46±2.19*正常對照組哮喘組甲基強的松龍組

2.2 血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平 哮喘組和甲基強的松龍組血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平均顯著高于正常對照組（P均＜0.05），而哮喘組血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平與甲基強的松龍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖2。

2.3 肺組織TRAF2表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，陽性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色表達(dá)，主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等，而肺組織中卻較少表達(dá)。哮喘組TRAF2光密度值顯著高于對照組和甲基強的松龍組（P均＜0.01），甲基強的松龍組TRAF2光密度值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表2、圖3。

表2 各組肺組織TRAF2表達(dá)水平（±s）

表2 各組肺組織TRAF2表達(dá)水平（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與哮喘組比較，△P＜0.01

n/只9 9 8 TRAF2（OD值）0.220±0.057 0.317±0.041*0.235±0.028△組 別對照組哮喘組甲基強的松龍組

圖1 流式細(xì)胞術(shù)顯示血淋巴細(xì)胞TLR1的散點圖

圖2 流式細(xì)胞術(shù)顯示血淋巴細(xì)胞FasL的散點圖

3 討論

哮喘的病因和發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點，TLR是新近發(fā)現(xiàn)的先天性免疫的病原模式識別受體，識別自身和異體抗原，介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞，激活炎癥因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［6］。TLR在慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，它介導(dǎo)的炎癥因子、細(xì)胞因子可導(dǎo)致哮喘氣道重塑［7］。在哮喘發(fā)病的“衛(wèi)生假說”機(jī)制中起著重要的作用，不管是先前的“衛(wèi)生假說”和新的“衛(wèi)生假說”，都認(rèn)為環(huán)境因素通過TLR影響著哮喘的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組血淋巴細(xì)胞TLR1的表達(dá)水平與對照組相近，提示TLR1可能不需要通過OVA誘導(dǎo)途經(jīng)激發(fā)；而甲基強的松龍能顯著提升TLR1的表達(dá)水平，提示甲基強的松龍的抗炎作用可能部分通過上調(diào)TLR1起作用。相似的研究也發(fā)現(xiàn)，OVA誘導(dǎo)的哮喘大鼠模型中，TLR4在哮喘組和對照組中無差別，而地塞米松可提升TLR4的表達(dá)［8］，支持糖皮質(zhì)激素可能通過TLR起到抗炎的作用的論點。

圖3 肺組織TRAF2的表達(dá)，陽性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色表達(dá)，主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞等（SP×200）

FasL屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子超家族成員，在體內(nèi)主要以膜結(jié)合形式存在，是一種Ⅱ型跨膜蛋白。FasL與細(xì)胞表面的Fas結(jié)合，可誘導(dǎo)表達(dá)Fas的靶細(xì)胞凋亡［9］。淋巴細(xì)胞通過此途徑，殺傷表達(dá)Fas的靶細(xì)胞。正常的Fas系統(tǒng)能有效地去除過度激活的免疫活性細(xì)胞，從而下調(diào)免疫反應(yīng)及細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的功能。在病理狀態(tài)下，可影響Fas的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡過程發(fā)生改變。本研究結(jié)果顯示，哮喘組血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），可能與哮喘患兒血淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)下降引起FasL反應(yīng)性升高有關(guān)［10］。甲基強的松龍不能下調(diào)FasL表達(dá)水平，提示它不是通過抑制FasL表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，但是否存在量效關(guān)系尚有待于進(jìn)一步研究。

TRAF2是TRAF家族的表達(dá)最為廣泛的TRAF家族成員，幾乎在所有組織中轉(zhuǎn)錄，能與TNFR家族中的大多數(shù)成員相互作用。TRAF2可以直接與TNF家族中的一些不含死亡結(jié)構(gòu)域的成員連接，也可以與細(xì)胞內(nèi)蛋白，包括MAP3K家族的蛋白酶、激活NF-κB調(diào)控因子、抗凋亡因子等相互作用，參與TNF-R1介導(dǎo)的NF-κB和JNK的激活過程，誘導(dǎo)基因表達(dá)，對多種生理過程十分重要，如細(xì)胞生長、死亡、發(fā)育、癌基因的表達(dá)、免疫和感染等［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，TRAF2主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中，而支氣管平滑肌中卻較少表達(dá)，提示它可能主要是通過氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞起作用。TRAF1的表達(dá)部位卻與之不同，它主要表達(dá)在支氣管平滑肌細(xì)胞，可能通過支氣管平滑肌細(xì)胞的途經(jīng)參與哮喘氣道高反應(yīng)性［12］。本研究還發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織TRAF2表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.01），提示TRAF2可能與哮喘的氣道炎癥有關(guān)。相似的研究也發(fā)現(xiàn)，在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞（嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、Th2細(xì)胞因子和氣道高反應(yīng)性顯著性增加，而TRAF1缺失的小鼠則無上述改變，認(rèn)為TRAF1可能是促進(jìn)哮喘炎癥的一個細(xì)胞因子［13］。上述表明，TRAF家族在哮喘的發(fā)病中可能起到致炎作用，抑制或阻斷TRAF信號通路可能是治療哮喘另一個有效的途經(jīng)。甲基強的松龍組TRAF2表達(dá)水平顯著下降，且與對照組相近，提示甲基強的松龍能有效地抑制TRAF2表達(dá)，且能達(dá)到正常的生理水平，其減輕氣道炎癥可能部分通過TRAF2途經(jīng)實現(xiàn)。

以上結(jié)果顯示，哮喘組大鼠FasL和TRAF2表達(dá)增加，它們可能參與了哮喘的炎癥機(jī)制；TLR1無變化，可能它不是通過OVA誘導(dǎo)途經(jīng)；甲基強的松龍能下調(diào)TRAF2和提升TLR1水平，從而起到抗炎的作用，但對FasL無影響。淋巴細(xì)胞可能通過FasL和TLR1參與哮喘炎病機(jī)制，此過程受甲基強的松龍調(diào)節(jié)。

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Regulation with Methylprednisolone on the Expression of Toll like receptor 1,FasL,and Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 2 in Asthmatic Rats

JIANG Defu,TONG Xiasheng,LUO Dongjiao,et al.The Second People’s Hospital of Wenling,Taizhou(317500),China

Objective：To investigate the potential effects of methylprednisolone on the expression of Toll like receptor 1(TLR1),FasL,and tumor necrosis factor receptor associated factor 2(TRAF2)in asthmatic rats.Methods:Twenty-seven SD rats were randomly divided into 3 groups,including asthma group,control group,and methylprednisolone-treated group.The levels of TLR1 and FasL in blood lymphocyte were detected by flow cytometry.The expression of TRAF2 protein was detected by immunohistochemical methods.Results:The level of TLR1 in the asthma group（47.58±1.46 ）MFI was significantly lower than that in the methylprednisolone-treated group（52.89±3.92 ）MFI(P＜0.05);The level of TLR1 in the control group did not differ to that in the asthma group or the methylprednisolone-treated group（all P＞0.05）.The level of FasL in the asthma group（15.52±0.53 MFI）and the methylprednisolone-treated group（14.46±2.19 MFI） were both significantly higher than that in the control group（11.73±1.39 MFI）(all P＜0.05),but no significant difference was noted between the asthma group and the methylprednisolone-treated group(P＞0.05).The expression of TRAF2 protein in the asthma group(0.317±0.041 optical density)was dramatically higher than that in the control group（0.220±0.057 optical density）and the methylprednisolone treated group(0.235±0.028 optical density)（all P＜0.01）,but no significant difference was seen between the methylprednisolone-treated group and the control group（P＞0.05）.Conclusion:The levels of FasL and TRAF2 were elevated and TLR1 had no change in asthmatic rats.The anti-inflammation role of methylprednisolone may be partly through down-regulating TRAF2 and up-regulating TLR1,but had no effect on FasL.

rats asthma Toll like receptor FasL tumor necrosis factor receptor associated factor glucocorticoids

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2007-B238），浙江省溫嶺市科技局基金資助項目（No.2009-2-55）

通迅作者：童夏生，E-mail:xshtzg@163.com

2012-01-13